Rapid High Throughput Amylose Bestemmelse i frysetørret kartoffelknolden Prøver
Summary
Denne protokol beskriver en højt gennemløb kolorimetrisk metode, der er baseret på dannelsen af et kompleks mellem iod og kæder af glucosemolekyler i stivelse. Jod danner komplekser med både amylose og lange kæder indenfor amylopektin. Efter tilsætning af jod til en stivelse prøve forekommer den maksimale absorption af amylose og amylopectin ved 620 og 550 nm. Den amylose / amylopektin-forholdet kan estimeres ud fra forholdet mellem de 620 og 550 nm absorbansværdier og sammenligne dem med en standardkurve i hvilke specifikke kendte koncentrationer afbildes mod absorptionsværdier. Dette høje gennemløb og billig metode er pålidelig og reproducerbar, tillader evaluering af store populationer af kartoffel kloner.
Abstract
Denne protokol beskriver en højt gennemløb kolorimetrisk metode, der er baseret på dannelsen af et kompleks mellem iod og kæder af glucosemolekyler i stivelse. Jod danner komplekser med både amylose og lange kæder indenfor amylopektin. Efter tilsætning af jod til en stivelse prøve forekommer den maksimale absorption af amylose og amylopectin ved 620 og 550 nm. Den amylose / amylopektin-forholdet kan estimeres ud fra forholdet mellem de 620 og 550 nm absorbansværdier og sammenligne dem med en standardkurve i hvilke specifikke kendte koncentrationer afbildes mod absorptionsværdier. Dette høje gennemløb og billig metode er pålidelig og reproducerbar, tillader evaluering af store populationer af kartoffel kloner.
Introduction
Ca. 80% af den friske vægt af en kartoffelknold er vand, og næsten al den tilbageværende tørstof er stivelse 1. De fleste af stivelse (70%) består af amylopectin, mens resten er amylose. Forholdet mellem amylose og amylopectin er den vigtigste egenskab at påvirke de fysiske egenskaber af stivelse. Amylose er en lineær alfa 1-4 glucose kæde, mens amylopectin er en lineær alfa 1-4 kæde med alpha 1-6 grene 2. Fremgangsmåder, såsom iod binding, differentiel scanningskalorimetri (DSC), højtydende gelpermeationskromatografi (HPSEC) og concanavalin A-interaktioner er blevet udviklet for stivelse bestemmelse i forskellige afgrødearter 3,4. Hver protokol kræver særlige færdigheder og udstyr, hvilket gør det svært at skalere op at kvantificere mange prøver ad gangen. Den metode, vi præsenterer her er en modificeret protokol fra Hovenkamp-Hermelink et al. 5, som er en dobbelt bølgelængde jod bindendemetode baseret på farvede stivelsesgranuler. Fordelene ved denne fremgangsmåde i forhold til andre omfatter amylose bestemmelse af rå stivelse uden oprensning deraf og anvendelse af den dobbelte bølgelængde system til at øge præcisionen af fremgangsmåden 4,6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Amyloseindhold i kartoffelknolde typisk fra 20-35% 7,8. Hvis de fleste værdier er uden for dette område, overveje disse mulige fejl: 1) rå data blev anvendt i stedet for slukkede data for konstruktionen af amylose / amylopektin standardkurve, 2) rå data blev anvendt i stedet for slukkede data til bestemmelse af amylose / amylopektin nøgletal fra kartoffel prøver, eller 3) det vand, der anvendes til analysen var ikke ren nok. Vi har bemærket, at ved anvendelse af destilleret vand og ikke ultra-ren…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansieringen af denne forskning blev leveret delvist af USDA-ARS Research Associate Program og USDA Crop germplasma udvalget.
Materials
| Reagents | |||
| Amylose | Sigma | 859656 | |
| Amylopectin | Sigma | A8515 | |
| Perchloric Acid 60% | Sigma | 311413 | Very hazardous to skin and eyes |
| Iodine | Sigma | 23214TD | |
| Potassium iodide | Sigma | 08625JE | |
| Equipment | |||
| Plate Reader | Bio Tek | ELx800 |
References
- Composition Hoover, R. molecular structure, and physicochemical properties of tuber and root starches: a review. Carbohydr. 45 (3), 253-267 (2001).
- Bertoft, E., Blennow, A. Structure of Potato Starch. Advances in Potato Chemistry and Technology. , 83-98 (2009).
- Campbell, M. R., Yeager, H., Abdubek, N., Pollak, L., Glover, D. Comparison of methods for amylose screening in maize starches from exotic backgrounds. Cereal Chem. 79, 317-321 (2002).
- Zhu, T., Jackson, D. S., Wehling, R. L., Geera, B. Comparison of amylose determination methods and the development of a dual wavelength iodine binding technique. Cereal Chem. 85, 51-58 (2008).
- Hovenkamp-Hermelink, J., Devries, J., Adamse, P., Jacobsen, E., Witholt, B., Feenstra, W. Rapid estimation of the amylose amylopectin ratio in small amounts of tuber and leaf tissue of the potato. Potato Res. 31, 241-246 (1988).
- Shannon, J. C., Garwood, D. L., Boyer, C. D. Genetics and Physiology of Starch Development. Starch. , 23-82 (2009).
- Haase, N. U., Plate, J. Properties of potato starch in relation to varieties and environmental factors. Stärke. 48 (5), 167-171 (1996).
- Johnston, F. B., Urbas, B., Khanzada, G. Effect of storage on the size distribution and amylose/amylopectin ratio in potato starch granules. Am. Pot. J. 45, 315-321 (1968).
- Gibson, T. S., Solah, V. A., McCleary, B. V. A procedure to measure amylose in cereal starches and flours with concanavalin A. J. Cereal Sci. 25 (2), 111-119 (1997).
- Sun, S., Matheson, N., Yun, S. -. H. Estimation of amylose content of starches after precipitation of amylopectin by concanavalin A. Starch. 42, 302-305 (1990).
