Gekoppelt Assays zur Überwachung Proteinrückfaltung in<em> Saccharomyces cerevisiae</em
Summary
Dieser Artikel beschreibt die Verwendung eines Leuchtkäfer-Luciferase-GFP-Fusionsprotein zu untersuchen,<em> In vivo</em> Proteinfaltung in<em> Saccharomyces cerevisiae</em>. Mit diesem Reagenz Rückfaltung eines Modells Hitze-denaturiertes Protein gleichzeitig durch Fluoreszenzmikroskopie und einem enzymatischen Assay, um die Rollen von Proteostase Netzkomponenten Proteinqualitätskontrolle Sonde überwacht werden.
Abstract
Proteostasis, da die kombinierten Prozesse der Proteinfaltung / Biogenese definiert ist Rückfaltung / Reparatur und Abbau, ein empfindliches Gleichgewicht, das zelluläre gehalten, um zu vermeiden schädliche Folgen 1 werden muss. Externe oder interne Faktoren, die dieses Gleichgewicht stören können, um Protein-Aggregation, Toxizität und Zelltod führen. Beim Menschen ist ein wichtiger Faktor, um die Symptome, die mit neurodegenerativen Erkrankungen wie Chorea Huntington, Parkinson-und Alzheimer-Krankheiten 10 verbunden. Es ist daher wichtig, dass die Proteine in der Instandhaltung von Proteostase beteiligt identifiziert werden, um Behandlungen für diese schwächenden Krankheiten zu entwickeln. Dieser Artikel beschreibt Techniken zur Überwachung in vivo Proteinfaltung in Quasi-Echtzeit Auflösung mit dem Modell Protein Glühwürmchenluciferase fusioniert mit grün fluoreszierende Protein (GFP-FFL). FFL-GFP ist ein einzigartiges Modell chimären Proteins als die FFL-Einheit ist extrem empfindlich auf Stress-induzierten misfolding und Aggregation, die das Enzym inaktiviert 12. Die Luciferase-Aktivität überwacht wird unter Verwendung eines enzymatischen Assay, und das GFP-Einheit stellt ein Verfahren zur Visualisierung von löslichen oder aggregierten FFL mit automatisierten Mikroskopie. Diese Methoden gekoppelt sind mit zwei parallel und technisch unabhängige Ansätze, sowohl Rückfaltung und funktionellen Reaktivierung eines Enzyms nach Stress zu analysieren. Aktivität Erholung können direkt mit Kinetik der Disaggregation und Re-Solubilisierung korreliert werden, um besser zu verstehen, wie Protein-Qualitätskontrolle Faktoren wie Protein Chaperone um diese Funktionen auszuführen zusammenarbeiten. Darüber hinaus können Deletionen oder Mutationen zur Beiträge von spezifischen Proteinen oder Protein-Untereinheiten diesem Verfahren getestet werden. In diesem Artikel untersuchen wir die Beiträge des Proteins disaggregase Hsp104 13, bekannt, eine Partnerschaft mit der Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) Rückfaltung System 5, zu Proteinrückfaltung, diesen Ansatz zu validieren.
Introduction
Beim Menschen neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer, Parkinson und Huntington-Krankheit haben Proteinfehlfaltungen und Aggregation 10 verbunden. Cells beschäftigen molekulare Chaperone, um kinetische Trapping von zellulären Proteinen in misfolded inaktiven Strukturen 6 zu verhindern. Chaperone Teilnahme in komplizierten Wechselwirkung Netzwerke innerhalb der Zelle, aber es ist nicht vollständig geklärt, wie die Summe dieser Wechselwirkungen organismal Proteostase beiträgt. Eines der wichtigsten Chaperone für die Mehrheit der cytosolischen Proteinfaltung ist die 70 kD Hitzeschockprotein (Hsp70) Familie 19. Es hat sich gezeigt, dass in der Hefe Verlust von Hsp70 verringert die Fähigkeit, entstehende heterolog exprimiert FFL zu falten und das endogene Protein, Ornithin transcarbamoylase, in vivo 18, 7 falten. Die Fähigkeit zur Analyse mit nahezu Echtzeit Auflösung Faltung erleichtern das Verständnis, wie zusätzliche zelluläre Faktoren contribute dieser Hsp70-abhängigen Prozess. Darüber hinaus Falten / Umfaltungsreaktionen möglicherweise nicht völlig abhängig von diesen Beitrag Proteine, so Assays muss empfindlich genug, um sowohl große als auch kleine Veränderungen in der Kinetik und Effizienz zu erfassen.
Die Hefezelle disaggregase, Hsp104, spielt eine wichtige Rolle bei der Reparatur von aggregierten Proteinen misfolded. Obwohl Hsp104 Homologe in Pilzen und Pflanzen identifiziert worden sind, erscheint diese Familie zu sein, in Metazoen abwesend. Es wurde vorgeschlagen, dass andere Chaperone wie denen des Hsp110 Familie einige der bekannten Hsp104 Aktivitäten in Säugetieren 16 durchzuführen. Hsp104 ist ein AAA +, hexameren Protein-Komplex, dass die Funktionen in der Hefe zu renovieren Proteinaggregaten, einen Beitrag zur Rückfaltung und Reparatur 13. Hsp104, zusammen mit der Hefe Hsp70, Ssa1 und der Hefe Hsp40, Ydj1, zur Verwertung von denaturiertem FFL in Hefezellen 5, 8 erforderlich. Die kleinen Hitzeschock-Protein, Hsp26, hat auch gezeigt, dass requi seinrot für Hsp104-vermittelte Aufschlüsselung der FFL 2.
FFL ist ein Zwei-Domänen-Protein, das das Substrat Luciferin in der aktiven Stelle und infolge einer Konformationsänderung, ATP und Sauerstoff decarboxyliert erfordert bindet das Substrat und setzt Oxiluciferin, Kohlendioxid (CO 2), Adenosinmonophosphat (AMP), und Licht 11, 9, 3. Die im Handel erhältlichen FFL Substrat, D-Luciferin, Ergebnisse in Lichtemission zwischen 550-570 nm, die unter Verwendung eines Luminometer 15 werden kann. FFL ist außerordentlich empfindlich auf Denaturierung von chemischen oder Wärmebehandlungen und Aggregate schnell beim Entfalten. Bei Temperaturen zwischen 39-45 ° C ausgesetzt FFL reversibel entfaltet und inaktivierten 12. Im Gegensatz dazu sind GFP und seinen Derivaten sehr widerstandsfähig gegen Proteinentfaltung Spannungen 14. Daher Fusion dieser beiden Proteine erlaubt FFL als experimentell labilen Rest, der Targeting-funktionelle Funktion gFP um intrazelluläre Ablagerungen, die visualisiert werden kann mittels Fluoreszenzmikroskopie in der Bevölkerung und der einzelnen Zelle Ebenen. Verwendung des enzymatischen Assay in einer halbautomatischen Multimode-Reader mit automatisierten Mikroskopie gekoppelt ermöglicht ungeahnte gleichzeitige Beurteilung der Kinetik und Ausbeute Umfaltungsreaktionen. Darüber hinaus ermöglicht die einfache Molekulargenetik des Modells Eukaryoten Saccharomyces cerevisiae sowohl präzise Manipulation des Proteins Qualitätskontrolle Netzwerk und die Möglichkeit für die Entdeckung Ansätze für neue Spieler einen Beitrag zur zellulären Stressantwort und Proteostase identifizieren.
In dieser Studie sind Wildtyp (WT) und Hsp104 Deletionsstämme Ausdruck FFL-GFP unterliegen Proteindenaturierungsmittel Hitzeschock. FFL-GFP Rückfaltung durch sowohl einen enzymatischen Test und Mikroskopie als Proxy Auslesen zur Reparatur des exprimierten Proteom in einer Erholzeit Verlauf überwacht. Wenn zu WT-Zellen im Vergleich zeigen wir the Hsp104 Deletionsstamm ist ~ 60% weniger effizient Rückfaltung FFL-GFP, die Unterstützung bisherigen Erkenntnisse über eine Rolle in Hsp104 Reaktivierung denaturierter FFL 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Artikel wird das Modell Protein FFL-GFP wurde verwendet, um zu zeigen, dass die Hefe disaggregase, Hsp104 zu Protein re-Solubilisierung und Reparatur trägt. Die enzymatische Assays und Mikroskopie differentiell den Status des gleichen Substrats Protein Rückfaltung Effizienz und Ausbeute zu bestimmen abgefragt. Ergebnisse der enzymatischen Assays Erholung vermuten, dass nicht nur der maximalen Erholung der hsp104D Mutantenstamm ineffizient, aber die anfängliche Größe der Entfaltung Spannung größ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Institutes of Health (NIGMS-074696) zu KAM und einer American Society of Microbiology Robert D. Watkins Graduate Student Research Fellowship an JLA Wir danken auch John Glover an der Universität von Toronto für die Bereitstellung der FFL unterstützt Source-GFP-Plasmid.
Materials
| Reagents | |||
| Synergy MX Microplate Reader | BioTek | ||
| Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope | Olympus, Tokyo Japan | ||
| Lumitrac 200 white 96-well plates | USA Scientific | ||
| SlideBook 5.0 digital microscopy software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA | ||
| Equipment | |||
| Tris Base | Fisher | BP152-1 | |
| (LiAc) Lithium Acetate | Sigma | L6883 | |
| PEG (polyethelene glycol) | Fisher | BP233-1 | |
| EDTA | Fisher | BP120-1 | |
| DMSO | Malinckrodt | 4948 | |
| SC | Sunrise | 1300-030 | |
| SC-URA | Sunrise | 1306-030 | |
| cycloheximide | Acros Organics | 357420050 | |
| D-luciferin | Sigma | L9504 | |
| low melt agarose | NuSieve | 50082 | |
| immersion oil | Cargille | 16484 |
References
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