מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em> Cerevisiae Saccharomyces</em
Summary
מאמר זה מתאר את השימוש בחלבון היתוך לוציפראז-GFP גחלילית לחקור<em> In vivo</em> קיפול חלבונים ב<em> Cerevisiae Saccharomyces</em>. שימוש מגיב זה, refolding של חלבון בחום מפוגל מודל יכול להיות במעקב בו זמנית על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי וassay אנזימטי לחקור את התפקידים של רכיבי רשת proteostasis בבקרת איכות חלבון.
Abstract
Proteostasis, שהוגדר כתהליכים המשולבים של קיפול חלבונים / biogenesis, refolding / תיקון, והשפלה, הוא איזון עדין סלולרי שחייבים להישמר, כדי למנוע השלכות מזיקות 1. גורמים חיצוניים או פנימיים המשבשים את האיזון הזה יכולים להוביל להצטברות חלבון, רעיל ומוות של תאים. אצל בני אדם זה הוא גורם מרכזי תורם לסימפטומים הקשורים בהפרעות ניווניות כגון הנטינגטון 10, פרקינסון, והמחלות אלצהיימר. לכן זה חיוני שהחלבונים המעורבים בתחזוקה של proteostasis להיות מזוהים על מנת לפתח טיפולים למחלות המתישות האלה. מאמר זה מתאר שיטות לניטור בקיפול חלבוני vivo ברזולוציה זמן כמעט אמיתית באמצעות לוציפראז גחלילית חלבון המודל התמזג חלבון פלואורסצנטי ירוק (FFL-GFP). FFL-GFP הוא חלבון chimeric מודל ייחודי כמחצית FFL היא רגישה מאוד ללחץ-Induced מ 'isfolding וצבירה, אשר מנטרלת את האנזים 12. פעילות לוציפראז היא פיקוח באמצעות assay אנזימטי, ומחצית GFP מספקת שיטה של הדמיה FFL המסיס או מצטבר באמצעות מיקרוסקופ האוטומטי. שיטות אלה בשילוב לשלב את שתי מקבילות ועצמאיים מבחינה טכנית גישות לניתוח והן refolding מחדש תפקודי של אנזים אחרי מתח. התאוששות פעילות יכולה להיות בקורלציה ישירה עם קינטיקה של disaggregation מחדש solubilization כדי להבין טוב יותר כיצד גורמי בקרת איכות חלבון כגון מלווים חלבון לשתף פעולה כדי לבצע פעולות אלה. בנוסף, ניתן להשתמש בו מחיקות או מוטציות גנטיות כדי לבדוק את תרומתם של חלבונים ספציפיים או יחידות משנת חלבון לתהליך זה. במאמר זה אנו בוחנים את תרומתם של חלבון disaggregase 13 Hsp104, ידוע לשותף עם גורם חילופי Hsp40/70/nucleotide (NEF) refolding מערכת 5, לrefolding חלבון כדי לאמת את הגישה הזאת.
Introduction
אצל בני אדם הפרעות ניווניות לרבות המחלות של הנטינגטון אלצהיימר, פרקינסון, ונקשרו לחלבון misfolding וצבירה 10. תאים להעסיק מלווים מולקולריים כדי למנוע השמנה הקינטית של חלבונים תאיים לתוך מבני 6 misfolded לא פעילים. מלווים להשתתף ברשתות אינטראקציה מורכבות בתוך התא, אך הוא לא הבין לגמרי איך הסכום של אינטראקציות אלה תורם לproteostasis האורגניזם. אחד מהמלווים העיקריים האחראים למרבית קיפול חלבוני cytosolic הוא חלבון 70 KD חום ההלם (Hsp70) המשפחה 19. הוכח כי באובדן שמרים של ירידות HSP70 היכולת לקפל FFL heterologously הביע המתהווה וכדי לקפל את חלבון אנדוגני, ornithine transcarbamoylase, ב18 vivo, 7. היכולת לנתח מתקפל עם רזולוציה קרובה זמן אמת יקל להבין כיצד גורמים נוספים המשך הסלולריribute לתהליך Hsp70 תלוי זה. בנוסף, קיפול / refolding תגובות לא יכול להיות תלוי לחלוטין בחלבונים התורמים אלה, ולכן מבחני חייבים להיות רגישים מספיק כדי לזהות את שני שינויים גדולים וקטנים בקינטיקה ויעילות.
Disaggregase תא השמרים, Hsp104, ממלא תפקיד חיוני בתיקון חלבוני misfolded מצטברים. למרות Hsp104 homologs זוהה בפטריות וצמחים, משפחה זו מופיעה להיעדר בmetazoans. זה הוצע כי מלווים אחרים, כגון אלו של משפחת Hsp110 לבצע חלק מפעילויות Hsp104 הידועות ביונקים 16. Hsp104 הוא +, חלבון מורכב hexameric AAA שמתפקד בשמרים לאגרגטים חלבון לשפץ, שתרם לrefolding ותיקון 13. Hsp104, יחד עם שמרי Hsp70, Ssa1, ושמרי Hsp40, Ydj1, נדרש להתאוששות של FFL מפוגל בשמרי תאים 5, 8. החלבון הקטן חום ההלם, Hsp26, גם הוכח להיות requiאדום לdisaggregation Hsp104 בתיווך של FFL 2.
FFL הוא חלבון שני תחום שנקשר luciferin המצע באתר הפעיל ובעקבות שינוי קונפורמציה שדורש ATP וחמצן, decarboxylates מצע שחרור oxyluciferin, פחמן דו חמצני (CO 2), monophosphate אדנוזין (AMP), ו -11 קלות, 9, 3. המצע זמין מסחרי FFL, D-luciferin, התוצאות בפליטת אור בין 550-570 ננומטר שניתן לאתר באמצעות luminometer 15. FFL הוא רגיש להפליא denaturation מטיפולים כימיים או חום ואגרגטים במהירות על התגלגלות. בעת חשיפה לטמפרטורות שבין 39-45 מעלות צלזיוס FFL הוא פרש הפיך ו12 מומתים. לעומת זאת, ה-GFP ונגזרותיו הם עמידים מאוד לחלבון התגלגלות לחצים 14. לכן שילוב של שני החלבונים האלה מאפשר FFL לתפקד כמחצית ניסוי יציבה מסוגלת מיקוד G הפונקציונליFP לתאי פיקדונות שניתן דמיינו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהוא על האוכלוסייה ורמות תא בודדות. יישום של assay אנזימטי בקורא צלחת multimode חצי אוטומטית בשילוב עם מיקרוסקופ האוטומטי מאפשר הערכה בו זמנית חסרת תקדים של קינטיקה תשואה של refolding תגובות. בנוסף, הגנטיקה המולקולרית הקלילה של cerevisiae Saccharomyces eukaryote המודל מאפשרת גם מניפולציה מדויקת של רשת בקרת איכות החלבון ואת ההזדמנות לגילוי המבוססים על גישות חדשניים כדי לזהות שחקנים שתרמו לתגובת לחץ התאי וproteostasis.
במחקר זה, זני הבר מסוג (WT) וHSP104 מחיקה להביע FFL-GFP כפופים להלם חום denaturing חלבון. refolding FFL-GFP הוא פיקוח באמצעות שניהם assay אנזימטי ומיקרוסקופיה כreadout proxy עבור תיקון של proteome בא לידי ביטוי לאורך כמובן זמן התאוששות. בהשוואה לתאי WT, אנו מראים הזן מחיקת Hsp104 דואר הוא ~ 60% פחות יעיל בrefolding FFL-GFP, התומכים בממצאים קודמים הקמת תפקיד לHsp104 בהפעלה מחדש של מפוגל FFL 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה מודל חלבון FFL-GFP שימש כדי להראות שdisaggregase השמרים, Hsp104 תורם לחלבון מחדש solubilization ותיקון. את מבחני וכן במיקרוסקופ אנזימטיות נחקרו באופן דיפרנציאלי את המצב של אותו חלבון המצע כדי לקבוע את היעילות ותשואת refolding. תוצאות של מבחני ההתאוששות אנזימטית עולה כי לא רק שההתא?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכון הלאומי לבריאות (074,696 NIGMS-) לKAM וחברה אמריקנית למיקרוביולוגיה מלגת רוברט ד 'ווטקינס סטודנט לתואר מחקר לJLA אנו מודים גם ג'ון גלובר באוניברסיטת טורונטו למתן FFL מקור-GFP פלסמיד.
Materials
| Reagents | |||
| Synergy MX Microplate Reader | BioTek | ||
| Olympus IX81-ZDC Confocal Inverted Microscope | Olympus, Tokyo Japan | ||
| Lumitrac 200 white 96-well plates | USA Scientific | ||
| SlideBook 5.0 digital microscopy software | Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO, USA | ||
| Equipment | |||
| Tris Base | Fisher | BP152-1 | |
| (LiAc) Lithium Acetate | Sigma | L6883 | |
| PEG (polyethelene glycol) | Fisher | BP233-1 | |
| EDTA | Fisher | BP120-1 | |
| DMSO | Malinckrodt | 4948 | |
| SC | Sunrise | 1300-030 | |
| SC-URA | Sunrise | 1306-030 | |
| cycloheximide | Acros Organics | 357420050 | |
| D-luciferin | Sigma | L9504 | |
| low melt agarose | NuSieve | 50082 | |
| immersion oil | Cargille | 16484 |
References
- Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
- Cashikar, A. G., Duennwald, M., Lindquist, S. L. A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104. J. Biol. Chem. 280, 23869-23875 (2005).
- Conti, E., Lloyd, L. F., Akins, J., Franks, N. P., Brick, P. Crystallization and preliminary diffraction studies of firefly luciferase from Photinus pyralis. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 52, 876-878 (1996).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R., Woods, R. A. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure. Yeast. 11, 355-360 (1995).
- Glover, J. R., Lindquist, S. Hsp104, Hsp70, and Hsp40: a novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins. Cell. 94, 73-82 (1998).
- Grantcharova, V., Alm, E. J., Baker, D., Horwich, A. L. Mechanisms of protein folding. Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 70-82 (2001).
- Kim, S., Schilke, B., Craig, E. A., Horwich, A. L. Folding in vivo of a newly translated yeast cytosolic enzyme is mediated by the SSA class of cytosolic yeast Hsp70 proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 12860-12865 (1998).
- Lum, R., Niggemann, M., Glover, J. R. Peptide and protein binding in the axial channel of Hsp104. Insights into the mechanism of protein unfolding. J. Biol. Chem. 283, 30139-30150 (2008).
- Marques, S. M., Esteves da Silva, J. C. Firefly bioluminescence: a mechanistic approach of luciferase catalyzed reactions. IUBMB Life. 61, 6-17 (2009).
- Morimoto, R. I. The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 76, 91-99 (2011).
- Nakatsu, T., et al. Structural basis for the spectral difference in luciferase bioluminescence. Nature. 440, 372-376 (2006).
- Nathan, D. F., Vos, M. H., Lindquist, S. In vivo functions of the Saccharomyces cerevisiae Hsp90 chaperone. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 12949-12956 (1997).
- Parsell, D. A., Kowal, A. S., Singer, M. A., Lindquist, S. Protein disaggregation mediated by heat-shock protein Hsp104. Nature. 372, 475-478 (1994).
- Penna, T. C., Ishii, M., Junior, A. P., Cholewa, O. Thermal stability of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) at various pH values. Appl. Biochem. Biotechnol. , 113-116 (2004).
- Seliger, H. H., Buck, J. B., Fastie, W. G., McElroy, W. D. The Spectral Distribution of Firefly Light. J. Gen. Physiol. 48, 95-104 (1964).
- Shorter, J. The mammalian disaggregase machinery: Hsp110 synergizes with Hsp70 and Hsp40 to catalyze protein disaggregation and reactivation in a cell-free system. PLoS One. 6, e26319 (2011).
- Tkach, J. M., Glover, J. R. Nucleocytoplasmic trafficking of the molecular chaperone Hsp104 in unstressed and heat-shocked cells. Traffic. 9, 39-56 (2008).
- Unno, K., Kishido, T., Hosaka, M., Okada, S. Role of Hsp70 subfamily, Ssa, in protein folding in yeast cells, seen in luciferase-transformed ssa mutants. Biol. Pharm. Bull. 20, 1240-1244 (1997).
- Verghese, J., Abrams, J., Wang, Y., Morano, K. A. Biology of the heat shock response and protein chaperones: budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) as a model system. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76, 115-158 (2012).
