Biosensor zum Nachweis von Antibiotika-resistenten Staphylococcus Bakterien
Summary
Lytic Phagen Biosensoren und Antikörper Perlen sind in der Lage, zwischen Methicillin-resistenten (MRSA) und empfindliche Staphylokokken Bakterien unterscheiden. Die Phagen wurden durch ein Langmuir-Blodgett-Technik auf einer Oberfläche einer Quarzkristall-Mikrowaage Sensor immobilisiert und arbeitete als breites Staphylococcus Sonden. Antikörper erkennen Perlen MRSA.
Abstract
Eine konstruktiv transformiert lytischen Bakteriophagen mit einem breiten Wirtsbereich von Staphylococcus aureus und Penicillin-Bindungsprotein (PBP 2a)-Antikörper, konjugiert Latex-Kügelchen wurden verwendet, um einen Biosensor zur Diskriminierung von Methicillin-resistenten (MRSA) und empfindlich (MSSA) S ausgelegt zu erstellen . aureus Arten 1,2. Die lytische Phagen in Phagen Sphäroide wurde durch Kontakt mit Wasser-Chloroform-Schnittstelle umgewandelt. Phagen Sphäroid Monoschichten haben auf einem Biosensor Oberfläche wurde durch Langmuir-Blodgett (LB)-Technik 3 bewegt. Die angelegten Biosensoren nach einem Quarzkristall mit Dissipationsmessung Verfolgung (QCM-D), um Bakterien-Phagen-Wechselwirkungen auswerten untersucht. Bakterien-Sphäroid Wechselwirkungen zu reduzierten Resonanzfrequenz und einem Anstieg in Dissipationsenergie sowohl für MRSA und MSSA Stämmen führte. Nach der bakteriellen Bindung haben diese Sensoren wurde weiter auf die Penicillin-bindende Protein Antikörper Latexperle ausgesetzts. Sensoren mit MRSA untersucht reagierte auf 2a Antikörper Perlen PBP, obwohl Sensoren mit MSSA inspiziert gab keine Antwort. Diese experimentelle Unterscheidung bestimmt eine eindeutige Unterscheidung zwischen Methicillin-resistenten und sensiblen S. aureus-Stämme. Ebenso gebundenen und ungebundenen Bakteriophagen unterdrücken das Wachstum von Bakterien auf Oberflächen und in Wasser-Suspensionen. Sobald lytischen Phagen in Sphäroide geändert werden, behalten sie ihre starke lytische Aktivität und zeigen eine hohe bakterielle Capture-Funktion. Die Phagen und Phagen Sphäroide können für die Prüfung und Sterilisation von Antibiotika-resistenten Mikroorganismen verwendet werden. Andere Anwendungen können die Verwendung in Bakteriophagen-Therapie und antimikrobielle Oberflächen.
Introduction
Methicillin-resistente Stämme von Staphylococcus aureus haben als ein Faktor in wesentlichen Infektionen und nosokomiale Ausbrüche 4-8 vorgeschlagen worden. Gemeinsame Wege der Anerkennung von Methicillin-Resistenz, wie die Scheibe Diffusion Oxacillin Agar Probeaufnahmen oder Bouillonmikrodilutions auf maßgeschneiderte Kulturbedingungen verlassen, um den Ausdruck des Widerstands zu verbessern. Änderungen umfassen die Verwendung von Oxacillin, Inkubation bei 30 oder 35 ° C statt 37 ° C, und die Aufnahme von NaCl zu dem Wachstumsmedium. Weiterhin für korrekte Erkennung durch diese Art von Techniken, eine lange Inkubationszeit von 24 h statt 16 bis 18 h erforderlich. Schnelle Techniken mit entsprechenden (> 96%) Empfindlichkeit für die Identifizierung von Methicillin-Resistenz sind automatisierte microdilution Techniken wie die Vitek GPS-SA-Karte, die Rapid-ATB Staph-System und Rapid Microscan Systemsteuerung System, Ergebnisse zu produzieren nach 3-11 h 9-11. The Crystal MRSA ID-System ist ein schnelles Verfahren auf Anerkennung des Wachstums von S. basierend aureus in Gegenwart von 2% NaCl und 4 mg Oxacillin pro Liter mit einem Sauerstoff-sensitive Fluoreszenz-Sensor. Beansprucht Empfindlichkeiten im Bereich zwischen 91 bis 100% nach 4 h Inkubation 12-14. Diese phänotypische Methoden sind in ihrer Genauigkeit durch die Auswirkungen der herrschenden Stämme, die heterogene Widerstand auszudrücken begrenzt. Daher ist die beste weithin akzeptierte Verfahren für die Anerkennung von Methicillin-Resistenz PCR oder DNA-Hybridisierung des mecA Gens 15. Allerdings erfordert diese Technik gereinigt DNA und ist äußerst empfindlich gegenüber verschiedenen Beimischungen (Verunreinigungen), die Zelltrümmer 16 umfassen.
Darüber hinaus müssen diese Verfahren eine lange Zeit durchzuführen. Strategien, um die Anerkennung des mecA Genprodukt Protein PBP 2a, könnte genutzt werden, um den Widerstand zu bestimmen und kann zuverlässiger im Vergleich zu Standard-Test-Techniken 17.
<p class = "jove_content"> Es wurde bereits früher gezeigt, dass Bakteriophagen 12600 als Sonde zur Erkennung Staphylococcus aureus-Stämme, einschließlich solche, die Methicillin-Resistenz 1,2,18 verwendet werden. In dieser Arbeit haben wir vorgeschlagen, eine neue Technik in der spezifischen Erkennung und Erkennung von MRSA, wie die Anerkennung von Bakterien zusammen mit Konformation von MRSA in Echtzeit. Für diesen speziellen Zweck ein S. aureus Bakteriophagen mit einem breiten Wirtsspektrum (einschließlich MRSA) mit einem monoklonalen Antikörper gegen Protein kombiniert (PBP 2a) verwendet wurden. PBP 2a eine Zellwandprotein und ist die Ursache von antibiotischen Widerstand von MRSA. Allerdings PBP 2a Antikörper ist nicht spezifisch für S. aureus seit einigen anderen Bakterien Antibiotika-bindende Proteine mit Sequenzähnlichkeit zu PBP 2a 19,20. Folglich in dieser Arbeit, S. aureus Bakteriophagen und Antikörper gegen PBP 2a Protein verwendet wurden. Um einen Biosensor zu entwickeln spezielltisch erkennen und zu identifizieren MRSA Ein Gerät mit einem zwei Schritten genutzt wurde. Der erste Schritt verwendet ein S. aureus Bakteriophagen Monoschicht als Sensor-Sonde, während der zweite Schritt PBP 2a spezifischen Antikörpern verwendet. Daher Schritt wird man erkennen, S. aureus Bakterien, als der andere empfindlich gegen das Antibiotikum-Bindungsprotein. Wenn Signale von zwei Schritten erhalten positiv sind, gibt es den spezifischen Nachweis von MRSA.Protocol
Representative Results
Discussion
Es ist bekannt, dass Phagen als Biosensor Sonden für bakterielle Erreger 28 verwendet werden. Es wird in dieser Arbeit gezeigt, dass Phagen zusammen mit PBP 2a Antikörper genutzt werden, um das alte Problem zu lösen: schnelle Diskriminierung antibiotikaresistenten und empfindliche Stämme.
Es wurde gefunden, jedoch diese normale unveränderte Staphylokokken Phagen nicht geeignet sind für Bakterien Detektion mit QCM Geräte, obwohl sie Bakterien binden. Die Phagen-Schwanz ist s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Arbeit hier berichtet wird, wurde durch Zuschüsse von der Auburn University und AUDFS USAF CRADA 07-277-60MDG-01 unterstützt. Die in diesem Artikel sind die der Autoren und spiegeln nicht die offizielle Politik oder Position der United States Air Force, Department of Defense, oder die US-Regierung.
Materials
| Reagents | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P4417 | |
| spectrophotometric-grade chloroform | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 154733 | (99.8% A.C.S.) |
| Hexane-Anhydrous | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 29609-0 | (95%) |
| Ethyl Alcohol | Pharmco products Inc. Brookfield, CT | 64-17-5 | 190 Proof |
| Equipment | |||
| PBP 2a antibody conjugated latex beads | Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan | The MRSA-Screen test | |
| S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from | American Type Culture Collection (Manassas, VA); | ||
| MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600 | The culture collection of Auburn University, Auburn, AL | ||
| Centrifuge | Beckman Coulter | Optima L-90K Ultra Centrifuge | |
| KSV 2200 LB film balance | KSV Chemicals, Finland | ||
| Light microscope optical system | CitoViva Technology Inc., Auburn, AL | ||
| QCM-D | Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden | E4 | |
| Scanning electron microscope (SEM) | JEOL USA Inc., Peabody, MA | JEOL-7000F SEM | |
| Transmitting electron microscopy (TEM) | JEOL USA Inc., Peabody, MA | JEOL, JEM 2010 | |
| Stericup, Presterilized | Millipore Corporation, Billerica, MA | SCGPU05RE | 0.22 μm, GP Express PLUS membrane |
| Bio-Assay dish | NUNC A/S, Denmark | 240835 | Dimensions(mm), 245 x 245 x 25 |
| Pipettes | Gilson, Pipetman, France | P100, P200, P1000 | |
| C24 Incubator Shaker | New Brunswick Scientific, CT | Classic C24 | |
| Gold-coated quartz pieces | Auburn University, AL | Homemade | |
| Petri dishes | Fisher Brand, USA | 0875713 | 100 mmX15 mm |
| SterilGard III Advance | The Baker Company, ME | SG403 | |
| Culture Growing Flasks | Corning Incorporated, NY | 4995 | PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks |
| Optical Spectrometer | Genesys 20. Thermo Spectronic, USA. | 4001 | |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma, USA | PDC-32G | |
| Millipore water purification system | Millipore | Direct-Q | |
| Imaging Ellipsometer | Accurion, USA | nanofilm_ep3se | |
| Software | Q-Sense AB, Sweden | QSoft, QTools |
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