抗生物質耐性ブドウ球菌の細菌の検出のためのバイオセンサー
Summary
溶菌ファージバイオセンサーと抗体ビーズメチシリン耐性（MRSA）と敏感ブドウ球菌の細菌を区別することができます。ファージを水晶振動子マイクロバランスセンサーの表面上にラングミュア·ブロジェット法で固定し、広範囲のブドウ球菌プローブとして働いていた。抗体ビーズはMRSAを認識しています。
Abstract
黄色ブドウ球菌株の広い宿主範囲およびペニシリン結合タンパク質（PBP 2a）の抗体共役ラテックスビーズは、メチシリン耐性（MRSA）および感受性（MSSA）Sの識別用に設計されたバイオセンサーを作成するために利用されているを有する構造的に形質転換された溶菌バクテリオファージ。ブドウ種 1,2。溶菌ファージは、水 – クロロホルムインタフェースとの接触によりファージスフェロイドに変換されている。ファージスフェロイド単層をラングミュア·ブロジェット（LB）法3でバイオセンサー表面上に移動されました。作成されたバイオセンサーは、細菌ファージの相互作用を評価するための放熱追跡と水晶振動子マイクロバランス（QCM-D）によって検討されている。細菌スフェロイド相互作用が減少し、共振周波数とMRSAとMSSA株の両方の消費エネルギーの上昇につながった。細菌結合した後、これらのセンサは、さらにペニシリン結合タンパク質抗体ラテックスビーズにさらされているS。 MRSAで分析センサーは2A抗体ビーズをPBPに応え、MSSAで検査センサーが応答を与えませんが。この実験的な区別は、メチシリン耐性と敏感S.間に明確な区別を決定黄色ブドウ球菌株 。同じようにバインドされ、バインドされていないバクテリオファージは、表面上、水懸濁液中の細菌の増殖を抑制する。溶菌ファージをスフェロイドに変更されると、彼らは強力な溶解活性を保持し、高い細菌の捕獲能力を示しています。ファージとファージスフェロイドは、抗生物質耐性微生物のテストおよび滅菌のために利用することができる。他のアプリケーションは、バクテリオファージ療法および抗菌面での使用を含むことができる。
Introduction
黄色ブドウ球菌のメチシリン耐性株は、本質的な感染症や院内アウトブレイク4-8の要因として示唆されている。このようなディスク拡散オキサシリン寒天スクリーンテスト、または微量液体希釈としてメチシリン耐性の認識の一般的な方法は、耐性の発現量を高めるために合わせた培養条件に依存している。変化は、成長培地に30または35でオキサシリン、インキュベーションの活用°Cではなく37℃以上、およびNaClのインクルージョンが含まれています。さらに、これらの種類の技法が正しい検出のため、24時間の代わりに16〜18時間の長い潜伏期間が必要である。メチシリン耐性を同定するための感度の適切な（> 96％）レベルの急速な技術は、バイテックGPS-SAカード、ラピッドATB黄色ブドウ球菌システム、及び3-11時間後に結果を生成する高速マイクロスキャンパネルシステムのような自動化された微量希釈法を含む9-11。クリスタルMRSA IDシステムは、Sの成長の認識に基づいて迅速な方法である2％NaClおよび酸素感受性蛍光センサー付リットルあたりオキサシリン4mgの存在下での黄色ブドウ球菌 。 91から100パーセントの間で感度の範囲は、インキュベーション12-14の4時間後に主張した。これらの表現型の方法は、異種の抵抗を発現普及している菌株の影響によりその精度が制限されている。したがって、メチシリン耐性の認識のための最高の広く受け入れられている方法はmecAの遺伝子15のPCRまたはDNAハイブリダイゼーションである。しかしこの手法は、精製されたDNAを必要とし、細胞の破片16を含む様々な混和剤（不純物）に非常に敏感です。
さらに、これらの技術は実行するのに長い時間を必要とする。 mecAの遺伝子産物、蛋白質PBP 2aとの認識戦略は抵抗を決定するために利用することができ、標準試験法17に比べて信頼性があってもよい。
<p clas秒= "jove_content">これは、以前のバクテリオファージ12600がメチシリン耐性1,2,18を有するものを含む黄色ブドウ球菌株の認識プローブとして利用することができることが示された。本研究ではこのようなリアルタイムでMRSAのコンフォメーションと一緒に細菌の認識などのMRSAの特異的認識と検出における新規手法を提案した。この特定の目的のためのS.タンパク質に対するモノクローナル抗体と組み合わせたホストの広いスペクトル（MRSA株を含む）と黄色ブドウ球菌バクテリオファージは、（PBP 2a）が使用されている。 PBP 2aは、細胞壁タンパク質であり、それはMRSAの抗生物質抵抗性の原因である。しかしPBP 2aの抗体は、S.のために固有のものではありませんいくつかの他の細菌から黄色ブドウ球菌は、PBP 2A 19,20に配列類似性と抗生物質結合タンパク質を持っている。そこで本研究では、S. PBP 2aの蛋白質に対する黄色ブドウ球菌バクテリオファージおよび抗体が使用されている。納入仕様にバイオセンサーを開発することができるようにする的に二段階のアクションが利用されていると、デバイスを検出し、MRSAを識別します。最初のステップは、Sを使用センサプローブとして球菌バクテリオファージ単層、2番目のステップはPBP 2A特異的な抗体を用いている。したがって、人はS.を認識し、手順黄色ブドウ球菌の細菌は、他の一人としての抗生物質結合タンパク質に敏感になります。二つのステップから受信された信号が正である場合には、MRSAの特異的検出を示す。Protocol
1。ステージの設定型株S.を得る球菌 ATCC 12600、S.球菌 ATCC 27690及び枯草菌 ATCC 6051。 S.のメチシリン耐性株黄色ブドウ球菌 – MRSA1、MRSA 2、MRSA 5、MRSA 13、MRSA 26、MRSA 34、MRSA 45、B.炭疽スターン、 ネズミチフス菌 LT2、 赤痢菌、エルシニアenterocolotica、プロテウス·ミラビリス、肺炎桿菌 13882;溶菌ファージ12600。 PBP 2aは抗体?…
Representative Results
ファージは、Sのすべてのテストされた株に対して溶菌活性を示しとしてファージスポット試験によって示さMRSA株、 黄色ブドウ球菌を含む、。プラークサイズは、通常5〜15 mmの範囲であった。活動は、他の試験培養物（ 表1）に対して、見つかりませんでした。 S.の正常な成長球菌 ATCC 12600は37℃シェーカー·インキュベーターでNZY?…
Discussion
それはよくファージを細菌性病原体28バイオセンサープローブとして使用できることが知られている。急速な差別抗生物質耐性および感受性株：これは、PBP 2aの抗体と一緒にファージは、古い問題を解決するために利用できることは、この研究で実証されている。
しかしながら、それらの正常な未変性ブドウ球菌ファージは、彼らが細菌に結合するにもかかわら?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ここに報告された作品は、オーバーン大学AUDFSとUSAF CRADA 07から277-60MDG-01からの補助金によって支えられて。この記事の見解は著者のものであり、アメリカ空軍、国防総省、または米国政府の公式政策や立場を反映するものではありません。
Materials
| Reagents | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | P4417 | |
| spectrophotometric-grade chloroform | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 154733 | (99.8% A.C.S.) |
| Hexane-Anhydrous | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 29609-0 | (95%) |
| Ethyl Alcohol | Pharmco products Inc. Brookfield, CT | 64-17-5 | 190 Proof |
| Equipment | |||
| PBP 2a antibody conjugated latex beads | Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Japan | The MRSA-Screen test | |
| S. aureus ATCC 12600, S. aureus ATCC 27690 and Bacillus subtilis ATCC 6051 from | American Type Culture Collection (Manassas, VA); | ||
| MRSA1, MRSA 2, MRSA 5, MRSA 13, MRSA 26, MRSA 34, MRSA 45, B. anthracis Sterne, Salmonella typhimurium LT2, Shigella flexneri, Yersinia enterocolotica, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae 13882; The lytic phage 12600 | The culture collection of Auburn University, Auburn, AL | ||
| Centrifuge | Beckman Coulter | Optima L-90K Ultra Centrifuge | |
| KSV 2200 LB film balance | KSV Chemicals, Finland | ||
| Light microscope optical system | CitoViva Technology Inc., Auburn, AL | ||
| QCM-D | Q-Sense AB, Västra Frölunda, Sweden | E4 | |
| Scanning electron microscope (SEM) | JEOL USA Inc., Peabody, MA | JEOL-7000F SEM | |
| Transmitting electron microscopy (TEM) | JEOL USA Inc., Peabody, MA | JEOL, JEM 2010 | |
| Stericup, Presterilized | Millipore Corporation, Billerica, MA | SCGPU05RE | 0.22 μm, GP Express PLUS membrane |
| Bio-Assay dish | NUNC A/S, Denmark | 240835 | Dimensions(mm), 245 x 245 x 25 |
| Pipettes | Gilson, Pipetman, France | P100, P200, P1000 | |
| C24 Incubator Shaker | New Brunswick Scientific, CT | Classic C24 | |
| Gold-coated quartz pieces | Auburn University, AL | Homemade | |
| Petri dishes | Fisher Brand, USA | 0875713 | 100 mmX15 mm |
| SterilGard III Advance | The Baker Company, ME | SG403 | |
| Culture Growing Flasks | Corning Incorporated, NY | 4995 | PYREX 250 ml Erlenmeyer flasks |
| Optical Spectrometer | Genesys 20. Thermo Spectronic, USA. | 4001 | |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma, USA | PDC-32G | |
| Millipore water purification system | Millipore | Direct-Q | |
| Imaging Ellipsometer | Accurion, USA | nanofilm_ep3se | |
| Software | Q-Sense AB, Sweden | QSoft, QTools |
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Cite This Article
Guntupalli, R., Sorokulova, I., Olsen, E., Globa, L., Pustovyy, O., Vodyanoy, V. Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria. J. Vis. Exp. (75), e50474, doi:10.3791/50474 (2013).