在鼠标提睾肌为外周干细胞迁移分析的微循环活体显微镜
Summary
鼠标M.提睾肌微循环活体显微镜提供了一个独特和良好的标准化的体内模型外围骨髓干细胞迁移的分析。
Abstract
在在再生细胞疗法的背景下血管内细胞应用协议的时代，干细胞迁移的基本机制，以nonmarrow组织尚未完全阐明。我们在这里描述的活体显微镜应用到小鼠提睾肌微循环在体内外周骨髓干细胞迁移的分析技术。分枝睾的活体显微镜已经在发炎的研究直接观察白细胞相互作用与血管内皮的字段先前介绍。因为充足的外周干细胞和祖细胞的迁移，包括沿与牢固粘附在轧制内皮衬里可以想到应用分枝睾模型intravasculary施用干细胞与内皮细胞的相互作用的观测和量化的相似的初始步骤。作为各种化学组分可以选择性地施加到目标吨问题通过简单的灌流技术，它可以建立必要的微环境的先决条件，初始的干细胞募集到发生在骨髓外的活的有机体。
Introduction
本条款的目的是描述活体显微镜的应用对小鼠提睾肌微循环直接观察外周血骨髓干细胞迁移和分析技术（IVM）。
干细胞的当前概念的基础组织和器官再生涉及骨髓来源的干细胞的归巢向受损组织1。对于成功的干细胞迁移的一个关键步骤包括干受伤器官其次是跨内皮迁移，最终器官移植2内与当地内皮细胞间的相互作用。这些干细胞的活体分析-内皮细胞相互作用形成了一个理想的参数用于在体内的病理生理不同设置的干细胞为基础的再生反应的定量。此外，似乎可以设想，即，在将来，特定的干细胞P上的迁移能力的活体分析在标准化的微循环环境opulations，可能会被应用之前推进这些人群进一步临床试验。
活体显微镜已初步开发了白细胞-内皮细胞相互作用在体内的观察和量化在炎症研究3的视场。活体显微镜研究的第一个成功的录音报道了Cohnheim已经在19世纪，研究在光学显微镜下4青蛙的舌头和肠系膜。自从第一次使用IVM发生了翻天覆地的技术发展到今天的某些基本组件构成，以便进行定量IVM的先决条件：（一）组织筹备工作，允许光纤接入，（II），可以通过显微镜来检测分子探针，（三），连接到检测系统及（iv）基于计算机分析系统，可以从图像数据中提取感兴趣的参数的显微镜设置4。
各种组织筹备工作已引入体外成熟的研究，包括肠系膜和小鼠和大鼠5，6小鼠和仓鼠，兔子耳朵和地鼠颊囊，仅举几例背侧皮褶室的肝脏。
然而，在下文中，我们将重点放在鼠标提睾肌，表示用于观察活体的理想的组织，作为制备和可视化是可能的通过公标准化的外科手术过程，和在一般的运动伪影的问题没有发生。开提睾肌的准备进行了第一次在20世纪70年代由贝兹和他的同事7。原本为大鼠描述，已经成功地采用了也鼠标8。经过以前的研究主要集中在与血管壁白细胞的相互作用，我们自己的小组最近推出的鼠标提睾肌整理作为VALUABLE工具直接观察和定义的微环境9内干细胞与血管内皮细胞相互作用的定量分析。各种干细胞亚群进行了研究，利用该模型，包括鼠的c-kit +骨髓干细胞和间充质干细胞，以及人类的CD133 +骨髓干细胞10-12。以下从供体骨髓和可视化的荧光标记细胞的分离，干细胞被选择性地施加到经股动脉，利用动脉注射提睾微循环，从而避免远端器官内的任何细胞截留。此外，由于各种趋化因子的相应设置内潜在介导局部干细胞的迁移，可局部施用于靶组织以简单灌流技术提睾肌模型是特别有用的。
Protocol
Representative Results
Discussion
活体荧光显微镜可以直接可视化和干细胞与血管内皮细胞相互作用的定量分析。提睾肌模型是非常有用的，因为显微曝光和技术活体可视化已经确立的白细胞 – 内皮细胞相互作用和各种化学组分的研究过程中可以选择性地施加到目标组织通过简单灌流技术。由于没有运动伪影和严重的图像噪声，这种特殊的模式，相较于其他的活体，镜设置，提供了用于细胞 – 细胞相互作用的可视化的最佳条?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
| Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA) | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | C1157 |
| Rhodamine 6 G (1%) | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | 83697 |
| Ketamin (Ketanest) | Pfizer, Berlin, Germany | not available |
| Xylacin (Rompun) | Bayer, Leverkusen, Germany | not available |
| Dulbecco's Phosphate – buffered saline (PBS) | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P04-36500 |
References
- Madlambayan, G. J., et al. marrow stem and progenitor cell contribution to neovasculogenesis is dependent on model system with SDF-1 as a permissive trigger. Blood. 114, 4310-4319 (2009).
- Lapidot, T., Dar, A., Kollet, O. How do stem cells find their way home?. Blood. 106, 1901-1910 (2005).
- Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells. Methods Enzymol. 300, 462-481 (1999).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surg. Endosc. 17, 939-942 (2003).
- Sriramarao, P., Anderson, W., Wolitzky, B. A., Broide, D. H. Mouse bone marrow-derived mast cells roll on P-selectin under conditions of flow in vivo. Lab Invest. 74, 634-643 (1996).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).
- Bagher, P., Segal, S. S. The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation. J. Vis. Exp. , e2874 (2011).
- Kaminski, A., et al. Endothelial NOS is required for SDF-1alpha/CXCR4-mediated peripheral endothelial adhesion of c-kit+ bone marrow stem cells. Lab Invest. 88, 58-69 (2008).
- Furlani, D., et al. HMGB-1 induces c-kit+ cell microvascular rolling and adhesion via both toll-like receptor-2 and toll-like receptor-4 of endothelial cells. J. Cell Mol. Med. 16, 1094-1105 (2012).
- Furlani, D., et al. Is the intravascular administration of mesenchymal stem cells safe? Mesenchymal stem cells and intravital microscopy. Microvasc. Res. 77, 370-376 (2009).
- Donndorf, P., et al. Analysing migratory properties of human CD 133(+) stem cells in vivo after intraoperative sternal bone marrow isolation. Cell Transplant. , (2012).
