Microscopia intravitale del microcircolo nel muscolo mouse Cremaster per l'analisi di migrazione delle cellule staminali periferiche
Summary
Microscopia intravitale del microcircolo cremastere topo M. offre un unico e ben standardizzato-modello in vivo per l'analisi del midollo osseo migrazione di cellule staminali periferiche.
Abstract
Nell'era della intravascolari protocolli di applicazione di cellule nel contesto della terapia cellulare rigenerativa, i meccanismi alla base della migrazione di cellule staminali per nonmarrow tessuto non sono stati completamente chiariti. Descriviamo qui la tecnica della microscopia intravitale applicata al cremastere microcircolazione del mouse per l'analisi del midollo osseo periferico migrazione delle cellule staminali in vivo. Microscopia intravitale del cremastere M. è stato precedentemente introdotto nel campo della ricerca infiammatorio per l'osservazione diretta dell'interazione dei leucociti con l'endotelio vascolare. Da staminali periferiche sufficiente e la migrazione delle cellule progenitrici include analoghe fasi iniziali di laminazione lungo e ferma adesione alla endoteliali che rivestono è concepibile applicare il modello cremastere M. per l'osservazione e la quantificazione dell'interazione delle cellule staminali somministrate intravasculary con l'endotelio. Come vari componenti chimici possono essere applicati selettivamente al bersaglio trilascio da semplici tecniche di superfusione, è possibile stabilire condizioni essenziali del microambiente, per l'assunzione iniziale di cellule staminali che si terrà in un organismo vivente al di fuori del midollo osseo.
Introduction
Lo scopo del presente articolo è quello di descrivere la tecnica della microscopia intravitale (IVM) applicato sul cremastere microcircolazione del mouse per l'osservazione diretta e l'analisi del midollo osseo migrazione di cellule staminali periferiche.
Rigenerazione dei tessuti e organi Il concetto attuale di cellule staminali basato comporta la homing delle cellule staminali del midollo osseo al tessuto danneggiato 1. Un passo fondamentale per la migrazione di cellule staminali successo include staminali interazione delle cellule con l'endotelio locale all'interno dell'organo feriti seguita dalla migrazione transendoteliale e, infine, organo attecchimento 2. Analisi intravital di queste cellule staminali – interazioni cellule endoteliali costituisce un parametro ideale per la quantificazione di una risposta rigenerativa basata sulle cellule staminali in differenti impostazioni fisiopatologiche in vivo. Inoltre, sembra concepibile, che, in futuro, analisi intravital della capacità migratoria di specifico p cellule staminaliopulations all'interno di ambienti microcircolazione standardizzati, potrebbero essere applicati prima avanzando queste popolazioni a ulteriori test clinici.
Microscopia intravital è stato inizialmente sviluppato per l'osservazione e la quantificazione delle interazioni cellula-endoteliale dei leucociti in vivo nel campo della ricerca infiammatorio 3. Le prime registrazioni di successo di studi di microscopia intravitale sono stati riportati da Cohnheim già nel 19 ° secolo, studiando lingue e mesenteri rana sotto un microscopio ottico 4. Dal suo primo uso IVM ha subito un enorme sviluppo tecnico e oggi alcuni componenti essenziali costituiscono prerequisiti per eseguire IVM quantitativa: (i) preparazioni di tessuto che consentono l'accesso ottico, (ii) sonde molecolari che possono essere rilevati da un microscopio, (iii ) un microscopio collegato ad un sistema di rilevamento e (iv) sistemi di analisi computerizzati in grado di estrarre i parametri di interesse dati di immagineset 4.
Una varietà di preparazioni di tessuto è stato introdotto per gli studi IVM compresi i mesenteri e il fegato di topo e nel ratto 5, le camere plica dorsale di topo 6 e il criceto, l'orecchio di coniglio e il sacchetto criceto guancia per citarne alcuni.
Tuttavia, nel seguito ci concentreremo sul muscolo cremastere topo, che rappresenta un tessuto ideale per le osservazioni intravitale, come la preparazione e la visualizzazione sono possibili da una procedura chirurgica ben standardizzata, e in generale non si verifichino problemi di artefatti da movimento. La preparazione cremastere muscolare aperta si è svolta per la prima volta nel 1970 da Baez e colleghi 7. Originariamente descritto per i ratti, è stato adottato con successo anche al mouse 8. Dopo gli studi precedenti si erano concentrati principalmente sulle interazioni leucociti con la parete del vaso, il nostro gruppo ha recentemente introdotto il mouse preparazione cremastere muscolo come valutaziostrumento BLE per visualizzazione diretta e l'analisi quantitativa di staminali interazioni cellula-endotelio in un microambiente definito 9. Varie sottopopolazioni di cellule staminali sono state studiate utilizzando questo modello, compresi murino c-kit + cellule staminali del midollo osseo e di cellule staminali mesenchimali, nonché CD umano cellule staminali del midollo osseo 133 + 10-12. Dopo aver isolato cellule da donatore di midollo osseo e marcatura fluorescente per la visualizzazione, le cellule staminali vengono selettivamente applicati nella microcircolazione cremastere utilizzando una iniezione arteriosa attraverso l'arteria femorale, evitando così qualsiasi intrappolamento cella all'interno organi remoti. Inoltre, il modello cremastere muscolare è particolarmente utile in quanto varie chemochine potenzialmente mediano la migrazione delle cellule staminali locale entro le rispettive impostazioni, possono essere applicati localmente al tessuto bersaglio di semplice tecnica superfusione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microscopia a fluorescenza intravital permette la visualizzazione diretta e l'analisi quantitativa delle interazioni cellula-endotelio staminali. Il modello cremastere muscolare è particolarmente utile, poiché l'esposizione microchirurgico e le tecniche di visualizzazione intravitale sono stati ben stabiliti nel corso della ricerca sulle interazioni leucociti-endotelio e vari componenti chimici può essere applicato selettivamente al tessuto bersaglio semplice tecnica superfusione. A causa dell'assen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
| Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA) | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | C1157 |
| Rhodamine 6 G (1%) | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | 83697 |
| Ketamin (Ketanest) | Pfizer, Berlin, Germany | not available |
| Xylacin (Rompun) | Bayer, Leverkusen, Germany | not available |
| Dulbecco's Phosphate – buffered saline (PBS) | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P04-36500 |
References
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