Прижизненные микроскопия микроциркуляцию в мышцах мыши Кремастер для анализа периферических стволовых клеток миграции
Summary
Прижизненные микроскопия кремастер микроциркуляции мыши М. предлагает уникальное и хорошо стандартизированы в естественных условиях модели для анализа периферической костного мозга миграции стволовых клеток.
Abstract
В эпоху внутрисосудистых прикладных протоколов клеток в контексте регенеративной клеточной терапии, основные механизмы миграции стволовых клеток в nonmarrow ткани не были полностью выяснены. Мы описываем здесь технику прижизненной микроскопии применяется к мыши кремастер микроциркуляции для анализа периферической костного мозга миграции стволовых клеток в естественных условиях. Прижизненные микроскопия M. кремастер был ранее введен в области воспалительного исследования для прямого наблюдения лейкоцитов взаимодействия с эндотелием сосудов. Поскольку достаточно периферических стволовых и миграции клеток-предшественников включает подобные начальные шаги вдоль прокатки и фирма адгезии на эндотелиальных выстраиваются вполне возможно применить кремастер модель М. за соблюдение и количественной оценки взаимодействия intravasculary вводимых стволовых клеток с эндотелием. Поскольку различные химические компоненты могут быть выборочно применена к целевой твопрос простыми методами суперфузии, можно установить необходимые микросреды предпосылки, для первоначального набора стволовых клеток, которая пройдет в живом организме вне костного мозга.
Introduction
Цель настоящей статьи заключается в описании технику прижизненной микроскопии (IVM) применяется на мыши кремастер микроциркуляции для непосредственного наблюдения и анализа периферической костного мозга миграции стволовых клеток.
Нынешняя концепция стволовых клеток на основе тканей и органов регенерации включает в ноль костного мозга стволовых клеток, полученных в поврежденной ткани 1. Важнейшим шагом для успешной миграции стволовых клеток включает стволовых взаимодействие клеток с местным эндотелия в поврежденного органа с последующим трансэндотелиальной миграции и в конечном итоге органов приживления 2. Прижизненные анализ этих стволовых клеток – эндотелия межклеточных взаимодействий образует идеальную параметр для количественного определения стволовых клеток на основе регенеративной реакции в различных патофизиологических настроек в естественных условиях. Кроме того, представляется предположить, что в будущем, прижизненной анализ миграционной способности конкретного стволовых клеток рopulations пределах стандартных условиях микроциркуляции, могут применяться до продвижения этих групп населения к дальнейшему клинических испытаний.
Прижизненные микроскопия была первоначально разработана для наблюдения и количественной оценки лейкоцитов-эндотелиальной взаимодействия клеток в естественных условиях в области воспалительного исследований 3. Первые успешные записи прижизненных исследований микроскопии сообщили Cohnheim уже в 19 веке, изучая языки и мезентерий лягушек под световым микроскопом 4. С момента своего первого использования IVM претерпела огромные технического развития, и сегодня некоторые существенные компоненты образуют предпосылки для того, чтобы выполнить количественную IVM: (I) тканей препараты, которые позволяют оптического доступа, (II) молекулярные зонды, которые могут быть обнаружены с помощью микроскопа, (III ) микроскоп подключен к системе обнаружения и (IV) систем анализа компьютерных основе, которые могут извлечь интересующие параметры из данных изображениянабор 4.
Разнообразие тканевых препаратов была введена для исследований КБПБ включая мезентериев и печени мыши и крысы 5 дорсальной кожных складок палат мыши 6 и хомяка, уха кролика и хомяка защечный мешок, чтобы назвать несколько.
Тем не менее, в дальнейшем мы сосредоточимся на мыши кремастер мышцы, представляющего собой идеальную ткань для прижизненных наблюдений, как подготовка и визуализация возможны с помощью хорошо стандартизированной хирургической процедуры, и вообще не возникает никаких проблем артефактов движения. Открытая подготовка кремастер мышцы проводилась впервые в 1970-х годах Баэз и его коллеги 7. Первоначально описано у крыс, было успешно принято также к мыши 8. После предыдущие исследования в основном сосредоточены на лейкоцитов взаимодействия с стенки сосуда, наша собственная группа недавно представила мыши подготовку кремастер мышц как ВалуаBLE инструмент для прямой визуализации и количественного анализа стволовых клеток эндотелия взаимодействий в пределах определенной микросреды 9. Различные субпопуляции стволовых клеток были изучены с использованием этой модели, в том числе мышей с-Kit + костного мозга стволовых клеток и мезенхимальных стволовых клеток, а также человеческого стволовых клеток CD + 133 костного мозга 10-12. После выделения клеток из костного мозга доноров и флуоресцентного мечения для визуализации, стволовые клетки селективно применяться в кремастер микроциркуляции с использованием артериальной инъекции через бедренную артерию, тем самым избегая клеток захвата в пределах удаленных органов. Кроме того, модель кремастер мышц особенно полезен, так как различные хемокины потенциально посреднические миграцию местного стволовых клеток в соответствующих настроек, могут местном применении к ткани-мишени по простой технологии суперфузии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Прижизненные флуоресцентной микроскопии позволяет прямой визуализации и количественного анализа стволовых клеток эндотелия взаимодействий. Модель кремастер мышц является особенно полезным, так как микрохирургической экспозиции и методы прижизненной визуализации были хорошо и…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
| Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA) | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | C1157 |
| Rhodamine 6 G (1%) | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | 83697 |
| Ketamin (Ketanest) | Pfizer, Berlin, Germany | not available |
| Xylacin (Rompun) | Bayer, Leverkusen, Germany | not available |
| Dulbecco's Phosphate – buffered saline (PBS) | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P04-36500 |
References
- Madlambayan, G. J., et al. marrow stem and progenitor cell contribution to neovasculogenesis is dependent on model system with SDF-1 as a permissive trigger. Blood. 114, 4310-4319 (2009).
- Lapidot, T., Dar, A., Kollet, O. How do stem cells find their way home?. Blood. 106, 1901-1910 (2005).
- Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells. Methods Enzymol. 300, 462-481 (1999).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surg. Endosc. 17, 939-942 (2003).
- Sriramarao, P., Anderson, W., Wolitzky, B. A., Broide, D. H. Mouse bone marrow-derived mast cells roll on P-selectin under conditions of flow in vivo. Lab Invest. 74, 634-643 (1996).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).
- Bagher, P., Segal, S. S. The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation. J. Vis. Exp. , e2874 (2011).
- Kaminski, A., et al. Endothelial NOS is required for SDF-1alpha/CXCR4-mediated peripheral endothelial adhesion of c-kit+ bone marrow stem cells. Lab Invest. 88, 58-69 (2008).
- Furlani, D., et al. HMGB-1 induces c-kit+ cell microvascular rolling and adhesion via both toll-like receptor-2 and toll-like receptor-4 of endothelial cells. J. Cell Mol. Med. 16, 1094-1105 (2012).
- Furlani, D., et al. Is the intravascular administration of mesenchymal stem cells safe? Mesenchymal stem cells and intravital microscopy. Microvasc. Res. 77, 370-376 (2009).
- Donndorf, P., et al. Analysing migratory properties of human CD 133(+) stem cells in vivo after intraoperative sternal bone marrow isolation. Cell Transplant. , (2012).
