Intramikroskopi av mikrosirkulasjonen i mus Cremaster Muscle for analyse av perifer stamcelle Migration
Summary
Intramikroskopi av musen M. cremaster mikrosirkulasjonen tilbyr et unikt og godt standardisert in vivo modell for analyse av perifer benmarg stamceller migrasjon.
Abstract
I den æra av intravaskulære celle protokollene i sammenheng med regenerativ celleterapi, de underliggende mekanismene for stamcelle migrasjon til nonmarrow vev er ikke helt avklart. Vi beskriver her teknikken for intravital mikros anvendt på mus cremaster mikrosirkulasjonen for analyse av perifert benmarg stamcelle migrering in vivo. Intravital mikros M. cremaster tidligere er innført i banen av inflammatoriske forskning for direkte observasjon av leukocytter interaksjon med det vaskulære endothelium. Siden tilstrekkelig perifere stilk og stamceller migrasjon har de samme innledende skritt av rullende langs og fast vedheft på endothelial fôr det er tenkelig å bruke M. cremaster modell for observasjon og kvantifisering av samspillet intravasculary administreres stamceller med endotelet. Ettersom forskjellige kjemiske komponenter kan selektivt påføres mot målet tproblemet ved enkle superfusjonsteknikker, er det mulig å etablere nødvendige microenviron forutsetninger, for innledende stamcelle rekruttering til å finne sted i en levende organisme utenfor benmargen.
Introduction
Hensikten med den foreliggende artikkelen er å beskrive teknikken for intravital mikroskopi (IVM) anvendt på mus cremaster mikrosirkulasjonen for direkte observasjon og analyse av perifert benmarg stamcelle migrasjon.
Den nåværende konseptet med stamcellebaserte vev og organ gjenfødelse innebærer homing av benmarg avledet stamceller til det skadde vevet en. Et viktig skritt for vellykket stamcelle migrasjon inkluderer stamcelle samspill med det lokale endotelet innenfor den skadde organ fulgt av transendothelial migrasjon og til slutt orgel engraftment to. Intravital analyse av disse stamcelle – endoteliale celle interaksjoner danner et ideelt parameter for kvantifisering av en stamcelle basert regenerativ respons på forskjellige patofysiologiske innstillinger in vivo. Videre synes det tenkes, at i fremtiden, intravital analyse av den vandrende antall spesifikke stamcelle populations innenfor standardiserte microcirculatory miljøer, kanskje før fremme disse populasjonene til ytterligere klinisk testing brukes.
Intravital mikroskopi ble opprinnelig utviklet for observasjon og kvantifisering av leukocytt-endotel-celle interaksjoner in vivo i feltet av inflammatorisk forskning 3.. Første vellykkede opptak av intramikroskopi studier ble rapportert av Cohnheim allerede på 19-tallet, studerte frosker tunger og mesenteries under et lysmikroskop fire. Siden første gangs bruk IVM har gjennomgått en enorm teknisk utvikling og i dag bestemte essensielle komponenter danner forutsetninger for å utføre kvantitative IVM: (i) vevspreparater som tillater optisk tilgang, (ii) molekylære prober som kan oppdages av et mikroskop, (iii ) et mikroskop koblet til et deteksjonssystem, og (iv) datamaskinbasert analysesystemer som kan trekke ut parametere av interesse fra bildedataenesatt fire.
En rekke vevspreparater har blitt introdusert for IVM studier samt mesenteries og lever av mus og rotter 5, de rygg skinfold kamre mus 6 og hamster, kanin øret og hamster kinnet posen for å nevne noen.
Men i det følgende vil vi fokusere på musen cremaster muskelen, som representerer en ideell vev for intra observasjoner, som forberedelse og visualisering er mulig ved en godt standardisert kirurgisk prosedyre, og generelt oppstår ingen problemer med bevegelse gjenstander. Den åpne cremaster muskel forberedelse ble gjennomført for første gang i 1970 av Baez og kolleger 7. Opprinnelig beskrevet for rotter, har det blitt tatt i bruk med hell også til muse 8.. Etter tidligere studier hadde i hovedsak fokusert på leukocytter interaksjoner med åreveggen, vår egen gruppe nylig introduserte musen cremaster muskel forberedelse som verdsetbart verktøy for direkte visualisering og kvantitativ analyse av stamcelle-endotel interaksjoner innenfor en definert mikromiljøet ni. Forskjellige stamcellepopulasjoner er blitt studert å benytte denne modellen, som blant annet murine c-kit + benmarg stamcelle-og mesenkymale stamceller, så vel som human CD 133 + benmarg stamceller 10-12. Etter celleisolasjon fra donor benmarg og fluorescerende merking for visualisering, har stamcellene selektivt anbringes i cremaster mikrosirkulasjon ved anvendelse av en arteriell injeksjon via den femorale arterie, og dermed unngå en hvilken som helst celle innesperring innen fjerntliggende organer. Videre er cremaster muskel modellen spesielt nyttige, siden forskjellige kjemokiner potensielt medierer lokale stamcelle migrering innenfor de respektive innstillinger, kan bli topikalt til målvevet ved enkel superfusjonsteknikk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Intra fluorescens mikroskopi tillater direkte visualisering og kvantitativ analyse av stamcelle-endotel interaksjoner. Den cremaster muskel-modellen er særlig nyttig, siden mikro eksponering og teknikker intravital visualisering er blitt vel etablert i løpet av forskningen på leukocytt-endotel interaksjoner og forskjellige kjemiske komponenter kan selektivt påføres på målvevet ved enkel superfusjonsteknikk. På grunn av fravær av bevegelse gjenstander og alvorlig bildestøy, denne modellen, i forhold til a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
| Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA) | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | C1157 |
| Rhodamine 6 G (1%) | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | 83697 |
| Ketamin (Ketanest) | Pfizer, Berlin, Germany | not available |
| Xylacin (Rompun) | Bayer, Leverkusen, Germany | not available |
| Dulbecco's Phosphate – buffered saline (PBS) | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P04-36500 |
References
- Madlambayan, G. J., et al. marrow stem and progenitor cell contribution to neovasculogenesis is dependent on model system with SDF-1 as a permissive trigger. Blood. 114, 4310-4319 (2009).
- Lapidot, T., Dar, A., Kollet, O. How do stem cells find their way home?. Blood. 106, 1901-1910 (2005).
- Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells. Methods Enzymol. 300, 462-481 (1999).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surg. Endosc. 17, 939-942 (2003).
- Sriramarao, P., Anderson, W., Wolitzky, B. A., Broide, D. H. Mouse bone marrow-derived mast cells roll on P-selectin under conditions of flow in vivo. Lab Invest. 74, 634-643 (1996).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).
- Bagher, P., Segal, S. S. The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation. J. Vis. Exp. , e2874 (2011).
- Kaminski, A., et al. Endothelial NOS is required for SDF-1alpha/CXCR4-mediated peripheral endothelial adhesion of c-kit+ bone marrow stem cells. Lab Invest. 88, 58-69 (2008).
- Furlani, D., et al. HMGB-1 induces c-kit+ cell microvascular rolling and adhesion via both toll-like receptor-2 and toll-like receptor-4 of endothelial cells. J. Cell Mol. Med. 16, 1094-1105 (2012).
- Furlani, D., et al. Is the intravascular administration of mesenchymal stem cells safe? Mesenchymal stem cells and intravital microscopy. Microvasc. Res. 77, 370-376 (2009).
- Donndorf, P., et al. Analysing migratory properties of human CD 133(+) stem cells in vivo after intraoperative sternal bone marrow isolation. Cell Transplant. , (2012).
