Intravital Mikroskopi av mikrocirkulationen i musen kremastermuskeln för analys av perifera stamcells Migration
Summary
Intravital mikroskopi av musen M. cremaster mikrocirkulation erbjuder en unik och väl standardiserat in vivo-modell för analys av perifera benmärg stamceller migration.
Abstract
I en tid präglad av intravaskulära cellapplikationsprotokoll i samband med regenerativ cellterapi, de bakomliggande mekanismerna för stamcells migration till nonmarrow vävnad har inte helt klarlagts. Vi beskriver här tekniken med intravital mikroskopi appliceras på musen cremaster mikrocirkulationen för analys av perifer benmärg stamceller migration in vivo. Intravital mikroskopi av M. cremaster tidigare har införts inom området inflammatorisk forskning för direkt observation av leukocyt interaktion med det vaskulära endotelet. Eftersom tillräcklig perifer stam och stamceller migration innehåller liknande initiala steg rullande längs och fast adhesion vid endothelial foder det är tänkbart att tillämpa M. cremaster modell för observation och kvantifiering av samverkan mellan intravasculary administrerade stamceller med endotelet. Eftersom olika kemiska komponenter kan selektivt appliceras på mål tproblemet genom enkla supertekniker, är det möjligt att fastställa viktiga microenvironmental förutsättningar, för första stamcells rekryteringen att ske i en levande organism utanför benmärgen.
Introduction
Syftet med denna artikel är att beskriva den teknik för intravital mikroskopi (IVM) tillämpas på musen cremaster mikrocirkulationen för direkt observation och analys av perifer benmärg stamceller migration.
Det nuvarande begreppet stamcellsbaserad vävnad och organregenere involverar målsökande av benmärg härrör stamceller i den skadade vävnaden 1. Ett avgörande steg för lyckad stamcells migrering omfattar stamceller samverkan med det lokala endotel i den skadade organet följt av transendotelial migration och slutligen organ engraftment 2. Intravital analys av dessa stamceller – endothelial cell interaktioner utgör en idealisk parameter för kvantifiering av en stamcellsbaserad regenerativ respons i olika patofysiologiska inställningar in vivo. Dessutom verkar det tänkbart, att, i framtiden, intravital analys av migrationskapacitet specifika stamcells populations inom standardiserade mikrocirkulatoriska miljöer, kan tillämpas innan avancera dessa befolkningar att ytterligare kliniska tester.
Intravital mikroskopi har ursprungligen utvecklats för observation och kvantifiering av leukocyt-endotel interaktion cell in vivo inom området inflammatoriska forskning 3. Första lyckade inspelningar av intravital mikroskopi studier rapporterades av Cohnheim redan på 19-talet, studerar grod tungor och mesenteries under ett ljusmikroskop 4. Sedan den första användningen IVM har genomgått en enorm teknisk utveckling och idag vissa viktiga komponenter utgör förutsättningar för att utföra kvantitativa IVM: (i) vävnadspreparat som medger optisk access, (ii) molekylära sonder som kan upptäckas genom ett mikroskop, (iii ) ett mikroskop som är ansluten till ett system för upptäckt och (iv) datorbaserade analyssystem som kan extrahera parametrar av intresse från bilddataset 4.
En mängd olika vävnadspreparat har införts för IVM studier inklusive mesenteries och lever i mus och råtta 5, de dorsala skinfold kamrar mus 6 och hamster, kanin öron och hamsterkindpåsen för att nämna några.
I det följande kommer vi att fokusera på musen kremastermuskeln, som representerar en idealisk vävnad för intravital observationer, som förberedelse och visualisering är möjligt genom en väl standardiserat kirurgiskt ingrepp, och i allmänhet inga problem med rörelseartefakter uppstå. Den öppna kremastermuskeln förberedelse genomfördes för första gången på 1970-talet av Baez och kollegor 7. Ursprungligen beskrivet för råttor har det antagits framgångsrikt även till mus-8. Efter tidigare studier hade främst fokuserat på leukocyt interaktion med kärlväggen, vår egen grupp nyligen infört musen kremastermuskeln förberedelse som en värderingble verktyg för direkt visualisering och kvantitativ analys av stemcell-endotel interaktioner inom ett definierat mikro 9. Olika stamcellspopulationer har studerats utnyttja denna modell, inklusive murina c-kit + benmärg stamceller och mesenkymala stamceller, samt den mänskliga CD 133 + benmärgsstamceller 10-12. Efter cellisolering från givare benmärg och fluorescerande märkning för visualisering, är stamceller selektivt tillämpat i cremaster mikrocirkulationen utnyttjar en arteriell injektion via lårbensartären, och därmed undvika någon cell entrapment inom avlägsna organ. Dessutom är kremastermuskeln modellen särskilt användbart eftersom olika kemokiner potentiellt förmedla lokala stamceller migration inom respektive inställningar, kan lokalt applicerad till målvävnaden genom enkel superfusionsteknik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Intravital fluorescensmikroskopi möjliggör direkt visualisering och kvantitativ analys av stemcell-endotel interaktioner. Kremastermuskeln modell är särskilt användbar, eftersom mikrokirurgisk exponering och tekniker intravital visualisering har blivit väl etablerat under forskning på leukocyt-endotel interaktioner och olika kemiska komponenter kan selektivt anbringas till målvävnaden genom enkel superfusionstekniken. På grund av avsaknaden av rörelse artefakter och svår bildbrus, just denna modell, i …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
| Carboxy-fluorescein diacetate succinimidylester (CFDA) | Invitrogen, Carlsbad, CA, USA | C1157 |
| Rhodamine 6 G (1%) | Sigma-Aldrich, Munich, Germany | 83697 |
| Ketamin (Ketanest) | Pfizer, Berlin, Germany | not available |
| Xylacin (Rompun) | Bayer, Leverkusen, Germany | not available |
| Dulbecco's Phosphate – buffered saline (PBS) | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P04-36500 |
References
- Madlambayan, G. J., et al. marrow stem and progenitor cell contribution to neovasculogenesis is dependent on model system with SDF-1 as a permissive trigger. Blood. 114, 4310-4319 (2009).
- Lapidot, T., Dar, A., Kollet, O. How do stem cells find their way home?. Blood. 106, 1901-1910 (2005).
- Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells. Methods Enzymol. 300, 462-481 (1999).
- Gavins, F. N., Chatterjee, B. E. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 49, 1-14 (2004).
- Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surg. Endosc. 17, 939-942 (2003).
- Sriramarao, P., Anderson, W., Wolitzky, B. A., Broide, D. H. Mouse bone marrow-derived mast cells roll on P-selectin under conditions of flow in vivo. Lab Invest. 74, 634-643 (1996).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).
- Bagher, P., Segal, S. S. The mouse cremaster muscle preparation for intravital imaging of the microcirculation. J. Vis. Exp. , e2874 (2011).
- Kaminski, A., et al. Endothelial NOS is required for SDF-1alpha/CXCR4-mediated peripheral endothelial adhesion of c-kit+ bone marrow stem cells. Lab Invest. 88, 58-69 (2008).
- Furlani, D., et al. HMGB-1 induces c-kit+ cell microvascular rolling and adhesion via both toll-like receptor-2 and toll-like receptor-4 of endothelial cells. J. Cell Mol. Med. 16, 1094-1105 (2012).
- Furlani, D., et al. Is the intravascular administration of mesenchymal stem cells safe? Mesenchymal stem cells and intravital microscopy. Microvasc. Res. 77, 370-376 (2009).
- Donndorf, P., et al. Analysing migratory properties of human CD 133(+) stem cells in vivo after intraoperative sternal bone marrow isolation. Cell Transplant. , (2012).
