Цифровой Инлайн Голографическая микроскопия (DIHM) субъектов слабо-рассеяния
Summary
Трехмерные местоположения слабо рассеивающих объектов может быть однозначно определены с помощью цифровой встроенный голографический микроскопии (DIHM), которая включает в себя незначительные изменения в стандартный микроскоп. Наше программное обеспечение использует простой визуализации эвристики в сочетании с Рэлея-Зоммерфельда обратного распространения, получая трехмерное положение и геометрию объекта микроскопической фазовой.
Abstract
Слабо-рассеивающих объектов, например, маленькие коллоидных частиц и большинства биологических клеток, часто встречаются в микроскопии. Действительно, целый ряд методов были разработаны, чтобы лучше визуализировать эти объекты фазовые; фазовый контраст и ДВС являются одними из самых популярных методов для повышения контрастности. Тем не менее, запись положение и форма в вышедшего из изображений плоскости направлении остается сложной. Этот отчет представляет простой экспериментальный метод, чтобы точно определять место и геометрию объектов в трех измерениях, используя цифровой встроенный голографический микроскопии (DIHM). Вообще говоря, доступный объем образца определяется размером датчика камеры в поперечном направлении, а также освещения когерентности в осевом направлении. Типичные объемы проб в диапазоне от 200 мкм х 200 мкм х 200 мкм с использованием светодиодной подсветкой, чтобы5 мм х 5 мм х 5 мм и более с помощью лазерной подсветки. Этот света для освещения сконфигурировано так, что плоские волны падают на образец. Объекты в объеме образца затем рассеивают свет, который мешает нерассеянной света, чтобы сформировать интерференционных картин, перпендикулярном направлению освещения. Это изображение (голограмма) содержит информацию о глубине, необходимое для трехмерной реконструкции, и может быть захвачен на стандартном устройстве формирования изображения, таком как КМОП или ПЗС-камеры. Метод обратного распространения Рэлея-Зоммерфельда используется для численно переориентировать микроскопа изображения, и простой визуализации эвристический на основе фазы Gouy аномалия используется для идентификации рассеяния объектов в реконструированном объема. Этот простой, но надежный метод приводит к однозначному, безмодельного измерения местоположения и формы предметов в микроскопических образцов.
Introduction
Цифровой встроенный голографический микроскопии (DIHM) позволяет быстро трехмерную визуализацию микроскопических образцов, таких как плавательные микроорганизмов 1,2 и мягких систем материи 3,4, с минимальными изменениями к стандартной установке микроскопа. В данной работе педагогического демонстрация DIHM обеспечивается, вокруг программного обеспечения, разработанного в нашей лаборатории. Эта статья включает в себя описание, как настроить микроскоп, оптимизировать сбор данных, и обрабатывать записанные изображения по реконструкции трехмерных данных. Программное обеспечение (основано частично на программное обеспечение, разработанное Д. Грира и другие 5) и например, изображения находятся в свободном доступе на нашем сайте. Краткое описание приведено из шагов, необходимых для настройки микроскопа, реконструкции трехмерных объемов от голограмм и делают получившиеся объемы интерес с помощью бесплатного трассировки лучей пакет программного обеспечения. В документе делается вывод с обсуждения факторов, влияющих на качество реконструкции, И сравнение DIHM с конкурирующими методами.
Хотя DIHM был описан некоторое время назад (для общего обзора ее принципов и разработки, см. Ким 6), требуемая вычислительная мощность и опыт обработки изображений до сих пор в значительной степени ограничили ее потребления специализированных исследовательских групп с упором на развитие приборов. Эта ситуация меняется в свете последних достижений в области вычислительной техники и технологии камеры. Современные настольных компьютеров может легко справляться с обработкой и требования к хранению данных; CCD или CMOS камеры присутствуют в большинстве микроскопии лабораторий и необходимая программа делается свободно доступны в Интернете по группам, которые вложили время в развитии техники.
Различные схемы были предложены для визуализации конфигурацию микрообъектов в трехмерном объеме пробы. Многие из них сканирования методы 7,8, в котором Стек изображений записаны мechanically перевод плоскость изображения через образец. Сканирующей конфокальной флуоресцентной микроскопии, пожалуй, самый известный пример. Как правило, флуоресцентный краситель добавляют к фазового объекта для достижения приемлемого уровня образца отличие от этого, и конфокальный устройство используется для пространственно локализовать флуоресцентное излучение. Этот метод привел к значительному прогрессу, например, в коллоидной науки, где он разрешен доступ к трехмерной динамики переполненных систем 9-11. Использование маркировки важное различие между флуоресценции конфокальной микроскопии и DIHM, но другие особенности двух методов являются стоит сравнивать. DIHM имеет значительное преимущество в скорости в том, что устройство не имеет движущихся частей. Механические зеркала сканирования в конфокальной системы установить верхний предел на скорость сбора данных – как правило, около 30 кадров / сек для 512 х 512 пикселя изображения. Стек таких изображений из разных фокальных плоскостях может быть получено физически Перляющего этап образца или объектив между кадрами, что приведет к окончательному скорости захвата около одного объема в секунду в течение кадра стека в 30. Для сравнения, голографическая система, основанная на современной CMOS камера может захватить 2000 кадр / с в то же размера и разрешения изображения, каждый кадр обрабатывается `в автономном режиме", чтобы дать независимую снимок объема образца. Повторюсь: люминесцентные образцы не требуются для DIHM, хотя система была разработана, который выполняет голографической реконструкции флуоресцентной теме 12. А также трехмерная информация объем, DIHM также может быть использован для обеспечения количественных изображения фазового контраста 13, но это выходит за рамки обсуждения здесь.
Изображения данных сырье DIHM являются двумерными, а в некоторых отношениях выглядят как обычные микроскопа изображений, хотя и не в фокусе. Основное различие между DIHM и стандартной яркий микроскопии лежит в дифракционных колец, которые окружают предметы ян поле зрения; это обусловлено характером освещения. DIHM требует более когерентный источник, чем светлом поле – обычно LED или лазерный. Дифракционных колец в голограммы содержит информацию, необходимую для реконструкции трехмерного изображения. Есть два основных подхода к интерпретации данных DIHM; монтируется непосредственно и численное переориентация. Первый подход применим в тех случаях, когда математическая форма дифракционной картины известных заранее 3,4; это условие выполняется небольшой горстки простых объектов, таких как сферы, цилиндры и полуплоскости препятствий. Прямая установка также применимо в тех случаях, когда осевое положение объекта, как известно, и изображение могут быть установлены с использованием справочной таблицы шаблонов изображения 14.
Второй подход (численный переориентации) является более общим и опирается на использование дифракционных колец в двумерной голограммы изображение, чтобы численно реконструировать оптического поля вряд (произвольно расположенных) фокальных плоскостях по всему объему образца. Существует несколько соответствующих методов для выполнения этой 6; эта работа использует Рэлея-Зоммерфельда назад технику распространения, как описано Ли и Грира 5. Итогом этой процедуры является Стек изображений, которые воспроизводят эффект ручного изменения фокальной плоскости микроскопа (отсюда и название `численное переориентация '). После того, как стек изображений был сформирован, положение объекта в фокальной объема должно быть получено. Ряд анализа изображений эвристики, таких как местные дисперсии интенсивности или пространственного частотного спектра, были представлены в количественной резкость фокуса в различных точках в образце 15. В каждом случае, когда конкретное изображение метрика максимизируется (или свести к минимуму), то объект считается в фокусе.
В отличие от других схем, которые стремятся идентифицировать конкретный фокальной плоскости, где объект находится «в фокусе», метод в этой работе выделяет рoints, которые лежат внутри объекта интереса, которые могут расширить в широком диапазоне фокусных плоскостей. Этот подход применим к широкому кругу предметов и особенно подходит для расширенных, слабо рассеивающих образцов (фаза объектов), например, в форме стерженьков коллоидов, цепей бактерий или эукариотической жгутиков. В таких образцах контрастность изображения изменяется, когда объект проходит через фокальной плоскости; расфокусированный изображение имеет светло-центр, если объект находится на одной стороне фокальной плоскостью и темным центром, если это с другой стороны. Объекты чистой фазе практически не имеют отличие, когда они лежат именно в фокальной плоскости. Это явление инверсии контраста был обсужден другими авторами 16,17 и, в конечном счете связано с фазой Gouy аномалия 18. Это была поставлена на более строгой основе в контексте голографии в другом месте, где пределы технике оцениваются; типичный неопределенность в положении порядка 150 нм (примерно один пиксель) в EACч направление 19. Метод фазовой аномалия Гуи является одним из немногих четко определенных схем DIHM для определения структуры протяженных объектов в трех измерениях, но тем не менее некоторые объекты являются проблематичными для восстановления. Объекты, которые лежат прямо вдоль оптической оси (указывая на камеру) трудно реконструировать точно; неопределенности в длине и положении объекта становятся большими. Это ограничение частично из-за ограниченного битной глубиной пикселов записи голограммы (число различных уровней серого, которые могут записывать камера). Еще одной проблемной конфигурации происходит, когда объектом интереса очень близко к фокальной плоскости. В этом случае, реальные и виртуальные образы объекта реконструируются в непосредственной близости, что приводит к сложным оптических полей, которые трудно интерпретировать. Второй, чуть менее важной задачей здесь является то, что в результате дифракции полосы занимают менее от датчика изображения, и этот крупном гранулометрическом инфormation приводит к реконструкции беднее качества.
На практике простой градиент фильтр применяется к трехмерных реконструированных объемов обнаружить сильные инверсии интенсивности вдоль направления освещения. Регионы, где интенсивность быстро изменения от светлого до темного, или наоборот, затем, связанные с рассеянием регионах. Слабо рассеивающие объекты хорошо описаны в качестве невзаимодействующих сбора таких элементов 20, эти суммы отдельных вкладов, чтобы дать общее рассеянное поле, которое легко перевернутой с помощью обратно способ распространения Рэлея-Зоммерфельда. В данной работе осевое техника градиент интенсивности применяется к цепи Streptococcus клеток. Клеточные тела фазовые объекты (виды кишечной палочки имеет показатель преломления, измеренный 21, чтобы быть 1.384 на длине волны λ = 589 нм; штамм Streptococcus, вероятно, будет похож) и появляются в виде высокой интенсивности цепь связанных капли в йОбъем э образец после градиентного фильтра была применена. Стандартные пороговые и художественные методы экстракции, применяемые к этой фильтрованной объеме позволит добычу объемных пикселей (вокселов), соответствующих области внутри клеток. Особым преимуществом этого метода является то, что она позволяет однозначно реконструкцию положение объекта в осевом направлении. Подобные методы (по крайней мере, те, которые записывают голограммы близко к объекту, распечатанных с помощью объектива микроскопа) страдают от невозможности определить знак этого смещения. Хотя метод реконструкции Рэлея-Зоммерфельда также регистрации независимой в этом смысле операция градиент позволяет нам различать слабых фазовых объектов выше и ниже фокальной плоскости.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наиболее важным шагом в этом протоколе является точной захват снимков с устойчивой экспериментальной установки. С бедных исходных данных, высокая реконструкция верность почти невозможно. Важно также, чтобы избежать объективы с внутренним контрастного элемента фазы (видимого в виде т…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Линда Тернер за помощь в микробиологической подготовки. Р.З. и LGW финансировались Rowland института в Гарварде и БГКП финансировалась как ученого накидки Фонда, науки без границ программы, Бразилия (Process # 7340-11-7)
Materials
| Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope | Nikon Corp. | ||
| LED | Thorlabs | M660L3 | emission wavelength λ=660 nm, linewidth approximately 20 nm |
| LED power supply | Thorlabs | LEDD1B | |
| Thread Adapter | Thorlabs | SM2T2 | |
| Thread Adapter | Thorlabs | SM1A2 | |
| Frame Grabber board | EPIX | PIXCI E4 | |
| High-Speed CMOS camera | Mikrotron | MC-1362 |
References
- Xu, W., Jericho, M. H., Meinertzhagen, I. A., Kreuzer, H. J. Digital in-line holography for biological applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (20), 11301-11305 (2001).
- Sheng, J., Malkiel, E., Katz, J., Adolf, J., Belas, R., Place, A. R. Digital holographic microscopy reveals prey-induced changes in swimming behavior of predatory dinoflagellates. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 17512-17517 (2007).
- Lee, S. H., Roichman, Y., et al. Characterizing and tracking single colloidal particles with video holographic microscopy. Opt. Express. 15 (26), 18275-18282 (2007).
- Fung, J., Martin, K. E., Perry, R. W., Katz, D. M., McGorty, R., Manoharan, V. N. Measuring translational, rotational, and vibrational dynamics in colloids with digital holographic microscopy. Opt. Express. 19 (9), 8051-8065 (2011).
- Lee, S. H., Grier, D. G. Holographic microscopy of holographically trapped three-dimensional structures. Opt. Express. 15 (4), 1505-1512 (2007).
- Kim, M. Principles and techniques of digital holographic microscopy. SPIE Rev. 1, 018005 (2010).
- Corkidi, G., Taboada, B., Wood, C. D., Guerrero, A., Darszon, A. Tracking sperm in three-dimensions. Biochem. Biophys. Res. Comm. 373, 125-129 (2008).
- Santi, P. Light Sheet Fluorescence Microscopy : A Review. J. Histochem. Cytochem. 59, 129-138 (2011).
- van Blaaderen, A., Wiltzius, P. . Real-Space Structure of Colloidal Hard-Sphere Glasses. Science. 270, 1177-1179 (1990).
- Besseling, R., Weeks, E. R., Schofield, A. B., Poon, W. C. K. Three-Dimensional Imaging of Colloidal Glasses under Steady Shear. Phys. Rev. Lett. 99, 028301 (2007).
- Schall, P., Weitz, D., Spaepen, F. Structural Rearrangements That Govern Flow in Colloidal Glasses. Science. 318, 1895-1899 (2007).
- Rosen, J., Brooker, G. Fluorescence incoherent color holography. Opt. Exp. 15, 2244-2250 (2007).
- Jericho, M. H., Kreuzer, H. J., Kanka, M., Riesenberg, R. Quantitative phase and refractive index measurements with point-source digital in-line holographic microscopy. Appl. Opt. 51 (10), 1503-1515 (2012).
- Mudanyali, O., Erlinger, A., Seo, S., Su, T., Ozcan, D. T. A. Lensless On-chip Imaging of Cells Provides a New Tool for High-throughput Cell-Biology and Medical. J. Vis. Exp. 34, (2009).
- Langehanenberg, P., Kemper, B., Dirksen, D., von Bally, G. Autofocusing in digital holographic phase contrast microscopy on pure phase objects for live cell imaging. Appl. Opt. 47 (19), (2008).
- Elliot, M. S., Poon, W. C. K. Conventional optical microscopy of colloidal suspensions. Adv. Coll. Interf. Sci. 92, 133-194 (2001).
- Agero, U., Monken, C. H., Ropert, C., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy. Phys. Rev. E. 67, 051904 (2003).
- Born, M., Wolf, E. . Principles of Optics, 6th Ed. , (1998).
- Wilson, L., Zhang, R. 3D Localization of weak scatterers in digital holographic microscopy using Rayleigh-Sommerfeld back-propagation. Opt. Express. 20, 16735-16744 (2012).
- Bohren, C., Huffman, D. . Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , (1983).
- Balaev, A. E., Dvoretski, K. N., Doubrovski, V. A. Refractive index of escherichia coli cells. Saratov Fall Meeting 2001: Optical Technologies in Biophysics and Medicine III. 4707 (1), 253-260 (2002).
- Berg, H. C., Manson, M. D., Conley, M. P. Dynamics and Energetics of Flagellar Rotation in Bacteria. Symp. Soc. Exp. Biol. 35, 1-31 (1982).
- Garcia-Sucerquia, J., Xu, W., Jericho, S. K., Klages, P., Jericho, M. H., Kreuzer, H. J. Digital in-line holographic microscopy. Appl. Optics. 45 (5), 836-850 (2006).
- Restrepo, J. F., Garcia-Sucerquia, J. Magnified reconstruction of digitally recorded holograms by Fresnel-Bluestein transform. Appl. Optics. 49 (33), 6430-6435 (2010).
- Dubois, F., Joannes, L., Legros, J. C. Improved three-dimensional imaging with a digital holography microscope with a source of partial spatial coherence. Appl. Optics. 38 (34), 7085-7094 (1999).
- Kanka, M., Riesenberg, R., Petruck, P., Graulig, C. High resolution (NA=0.8) in lensless in-line holographic microscopy with glass sample carriers. Opt. Lett. 36 (18), 3651-3653 (2011).
- Dubois, F., Requena, M. L., Minetti, C., Monnom, O., Istasse, E. Partial spatial coherence effects in digital holographic microscopy with a laser source. Appl. Optics. 43 (5), 1131-1139 (2004).
- Magariyama, Y., Sugiyama, S., Muramoto, K., Kawagishi, I., Imae, Y., Kudo, S. Simultaneous measurement of bacterial flagellar rotation rate and swimming speed. Biophysical Journal. 69 (5), 2154-2162 (1995).
- Berg, H. C., Brown, D. A. Chemotaxis in Escherichia coli analysed by three-dimensional tracking. Nature. 239 (5374), 500-504 (1972).
- Brooker, G., Siegel, N., Wang, V., Rosen, J. Optimal resolution in Fresnel incoherent correlation holographic fluorescence microscopy. Opt. Express. 19 (6), 5047-5062 (2011).
