Die<em> In ovo</em> CAM-Assay als Xenograftmodel für Sarkom
Summary
Die<em> In ovo</em> Chorioallantoismembran (CAM) wird mit frischem Sarkom-derived Tumorgewebe, deren einzelne Zelle Suspensionen und permanente und transiente fluoreszenzmarkierten etablierten Sarkom-Zelllinien gepfropft. Das Modell dient zur Graft-(Lebensfähigkeit, Ki67 Proliferationsindex, Nekrosen, Infiltration) und Host (Fibroblasten-Infiltration, vaskuläre Einwachsen) Verhalten zu studieren.
Abstract
Sarkom ist eine sehr seltene Krankheit, die heterogen in der Natur ist, die alle negativ auf die Entwicklung neuer Therapien. Sarkom-Patienten sind ideale Kandidaten für die personalisierte Medizin nach einer Schichtung, erklärt die aktuelle Interesse an der Entwicklung eines reproduzierbaren und Low-Cost-Xenotransplantationsmodell für diese Krankheit. Die Küken Chorioallantoismembran ist eine natürliche immungeschwächten Wirt fähig ist, ein dauerhaftes gepfropft Geweben und Zellen ohne Spezies-spezifische Einschränkungen. Darüber hinaus ist es leicht zugänglich, manipuliert und abgebildet, die optische und Fluoreszenz-Stereomikroskopie. Histologie weiteren ermöglicht die detaillierte Analyse der zellulären Interaktionen heterotypic.
Dieses Protokoll beschreibt im Detail die in ovo Pfropfen des Chorioallantoismembran mit frischen Sarkom-derived Tumorgewebe, deren einzelne Zelle Suspensionen und permanente und transiente fluoreszenzmarkierten etablierten Sarkom-Zelllinien (Saos-2 und SW1353). Die Küken Überleben Rattees sind bis zu 75%. Das Modell dient zur Graft-(Lebensfähigkeit, Ki67 Proliferationsindex, Nekrosen, Infiltration) und Host (Fibroblasten-Infiltration, vaskuläre Einwachsen) Verhalten zu studieren. Bei lokalisierten Pfropfen Einzelzellsuspensionen bietet ECM Gel deutliche Vorteile gegenüber inerten Materialien Containment. Die Ki67 Proliferationsindex auf den Abstand der Zellen von der Oberfläche der Nocke und der Dauer der Anwendung auf dem CAM, wobei letztere Bestimmung eines Zeitrahmens für die Zugabe von therapeutischen Produkten in Zusammenhang stehen.
Introduction
Sarkom ist ein seltener Tumor des Bindegewebes mit einer hohen Sterblichkeit aufgrund von Therapieresistenz 1,2. Fortschritte in der das Überleben der Patienten ist durch ihre geringe jährliche Inzidenz, ihrer breiten Vielfalt und der Tatsache, dass Sarkomzellen gemeldet sind schwer zu Kultur in vitro 3,4 behindert.
Die Verwendung von kultivierten Zellen für die präklinische Therapie Auswertung hat ergeben, dass neue, scheinbar aktive Moleküle in vitro nicht immer die Ergebnisse im klinischen Umfeld. Darüber hinaus sind Genom Aberrationen Genexpressionsarrays zeigte nicht immer korreliert Tumorverhalten Merkmale in den einzelnen Patienten 5-7. Um zu versuchen und diese Probleme zu lösen, hat die personalisierte Medizin an Bedeutung, die in der zunehmenden Suche nach Xenotransplantatmodellen 8-12 reflektiert wird gewonnen.
Ein in vivo Test hat den Vorteil, was die komplexe Zusammenspiel zwischen cancer Zellen und das Wirtsgewebe Umwelt in soliden Tumoren, die für Krebs Proliferation und Invasion 13. Derzeit untersuchen wir die Verwendung des Chorioallantoismembran Assay (CAM-Assay) als reproduzierbare Xenograftmodell für Sarkom 14,15. Dieser Test wird weithin für die Untersuchung von Tumor-Angiogenese 16,17 verwendet. In der Literatur sind jedoch haben wir verschiedene Protokolle für diesen Test gefunden, während andere Studien beobachtet einen deutlichen Unterschied im Wachstum oder die Angiogenese nach unterschiedlichen Protokollen 18,19.
In diesem Artikel untersuchen wir die Wirkung der unterschiedlichen Bedingungen des CAM-Assay auf das Verhalten der Zelle mit Tumortransplantate, tumorderivierten Einzelzellsuspensionen und etablierten Sarkom Zellkulturen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zeit der Impfung und Ernte
Timing der Tag der Impfung durchgeführt wurde mit Saos2 in ECM-Gel (36 CAMs) und variiert zwischen Embryonalentwicklung Tag 5 und 10.
Vor der Inkubation Tag 9 war das CAM nicht konsequent groß genug, um die ECM-Gel aufgetragen wir unterstützen. Bei der Ernte, Tumorzellen manchmal musste aus dem tieferen CAM abgerufen werden, und einige ECM Gel Proben wurden lose liegend im Eiweiss oder auf der CAM. An den Tagen, 5 und 6, war es schwer z…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Zellen aus dem SW1353 Chondrosarkom-Zelllinie wurden freundlicherweise von Prof. Dr. PCW Hogendoorn und Prof. Dr. J. Bovée der Universität Leiden, Niederlande vorgesehen. Wir danken J. und G. Mestach Wagemans für hervorragende technische Unterstützung, und G. De Bruyne für die professionelle Darstellung der Überblick über unsere Protokoll.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Amaxa | VCA-1003 |
| collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640) | Sigma Aldrich | C6885 |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 |
| DMSO | Sigma | D8418 |
| Dnase solution | Sigma Aldrich | DN25 |
| G418 | Invitrogen | 11811031 |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E1270 |
| mouse primary monoclonal antibody Ki67 | Dako Denmark | MIB-1 |
| Paraformaldehyde | Fluka | D76240 |
| PBS | Invitrogen | 20012019 |
| PBSD | Invitrogen | 14040083 |
| peGFP-C1 vector | Clontech | 632470 |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140163 |
| RPMI | Invitrogen | 22409-015 |
| Trypsin-EDTA solution | Invitrogen | 25300054 |
| Vybrant cell-labeling DiI | Lifetechnologies | 22885 |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 |
| digital color camera | Leica | DFC 340 FX |
| Digital Egg Incubator | Auto Elex Co | R-COM 50 |
| FACS | BD Biosciences | FACSAriaIII |
| Gentlemacs C-Tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 |
| Gentlemacs Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 |
| Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol | Miltenyi Biotech | |
| semipermeable adhesive film (Suprasorb F) | Lohmann&Rauscher | 20468 |
| stereo fluorescence microscope | Leica | M205 FA |
| Tissue-Tek Film automated Coverslipper | Sakura | 6400 |
| ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana Medical Systems Inc | 760-500 |
| Ventana Automated Slide Stainer | Ventana Medical Systems | Benchmark XT |
References
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