De<em> In ovo</em> CAM-assay als Xenograftmodel voor sarcoom
Summary
De<em> In ovo</em> Chorioallantoïsmembraan (CAM) is geënt met verse sarcoom-afgeleide tumor weefsel, hun single cell suspensies, en permanente en tijdelijke fluorescent gelabelde opgericht sarcoma cellijnen. Het model wordt gebruikt om graft-(levensvatbaarheid, Ki67 proliferatie-index, necrose, infiltratie) en gastheer (fibroblast infiltratie, vasculaire ingroei) gedrag te bestuderen.
Abstract
Sarcoom is een zeer zeldzame ziekte die is heterogeen van aard, alle die de ontwikkeling van nieuwe therapieën. Sarcoom patiënten zijn ideale kandidaten voor gepersonaliseerde geneeskunde na stratificatie, het uitleggen van de huidige belangstelling voor de ontwikkeling van een reproduceerbare en low-cost xenotransplant model voor deze ziekte. Het kuiken chorioallantoïsmembraan is een natuurlijk immunodeficiënte gastheer staat is tot duurzame geënt weefsels en cellen zonder soortspecifieke beperkingen. Bovendien is het eenvoudig te bereiken, gemanipuleerd en afgebeeld met behulp van optische en fluorescentie stereomicroscopie. Histologie maakt verdere gedetailleerde analyse van heterotypische cellulaire interacties.
Dit protocol beschrijft in detail de in ovo enten van het chorioallantoïsmembraan verse sarcoom afgeleide tumorweefsels, hun enkelvoudige celsuspensies en permanente en tijdelijke fluorescent gelabelde vastgesteld sarcoma cellijnen (Saos-2 en SW1353). De kuikenoverleving rates zijn tot 75%. Het model wordt gebruikt om graft-(levensvatbaarheid, Ki67 proliferatie-index, necrose, infiltratie) en gastheer (fibroblast infiltratie, vasculaire ingroei) gedrag te bestuderen. Voor gelokaliseerde enten van enkele cel suspensies, ECM gel biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van inerte insluiting materialen. De Ki67 celproliferatie is gerelateerd aan de afstand van de cellen van het oppervlak van de CAM en de duur van de toepassing van de CAM, deze bepaling een tijdschema voor de toevoeging van therapeutische producten.
Introduction
Sarcoom is een zeldzame tumor van het bindweefsel met een hoog sterftecijfer als gevolg van therapie resistentie 1,2. Vooruitgang in overleving patiënt wordt gehinderd door hun lage jaarlijkse incidentie, hun grote diversiteit, en het feit dat sarcoom cellen worden gerapporteerd aan hard om cultuur in vitro 3,4.
Het gebruik van gekweekte cellen voor preklinische therapie evaluatie blijkt dat nieuwe, blijkbaar actieve moleculen in vitro niet altijd met resultaten in de klinische setting. Bovendien genoom afwijkingen onthuld door genexpressie arrays zijn niet altijd gecorreleerd met tumor gedragskenmerken bij de individuele patiënt 5-7. Om te proberen en het oplossen van deze problemen, is gepersonaliseerde geneeskunde aan belang gewonnen, die wordt weerspiegeld in de toegenomen zoektocht naar xenograftmodellen 8-12.
Een in vivo assay heeft het voordeel dat als gevolg van de complexe wisselwerking tussen cancer cellen en het gastheerweefsel milieu in vaste tumoren, noodzakelijk voor proliferatie en invasie 13 kanker. Momenteel bestuderen we het gebruik van het Chorio-allantoïs membraan assay (CAM-assay) als reproduceerbaar xenograft model voor sarcoom 14,15. Deze test wordt veel gebruikt voor de studie van tumorangiogenese 16,17. In de literatuur, hebben we echter verschillende protocollen voor deze test gevonden, terwijl andere studies waargenomen een duidelijk verschil in groei of angiogenese volgens verschillende protocollen 18,19.
In dit artikel wordt het effect van variabele condities van de CAM-assay op mobiele gedrag met behulp van tumor enten, tumorafgeleide enkele cel suspensies en gevestigde sarcoom celculturen onderzoeken we.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tijd van inenting en oogst
Timing de dag van inoculatie werd uitgevoerd middels SAOS2 in ECM gel (36 CAMs) en varieerde tussen embryonale ontwikkeling dag 5 en 10.
Vóór incubatie dag 9, de CAM niet altijd groot genoeg om de ECM gel pasten we ondersteunen. Bij de oogst, tumorcellen soms moest worden opgehaald uit de diepere CAM en sommige ECM gelmonsters werden los liggen in het eiwit of op de CAM. Op dag 5 en 6, het was moeilijk om te vermijden dat de tumorcellen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cellen van de SW1353 chondrosarcoma cellijn werden vriendelijk verschaft door prof. dr. PCW Hogendoorn en prof. dr. J. Bovee van de Universiteit Leiden, Nederland. Wij danken J. Mestach en G. Wagemans voor een uitstekende technische bijstand, en G. De Bruyne voor de professionele tekening van het overzicht van ons protocol.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Amaxa | VCA-1003 |
| collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640) | Sigma Aldrich | C6885 |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 |
| DMSO | Sigma | D8418 |
| Dnase solution | Sigma Aldrich | DN25 |
| G418 | Invitrogen | 11811031 |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E1270 |
| mouse primary monoclonal antibody Ki67 | Dako Denmark | MIB-1 |
| Paraformaldehyde | Fluka | D76240 |
| PBS | Invitrogen | 20012019 |
| PBSD | Invitrogen | 14040083 |
| peGFP-C1 vector | Clontech | 632470 |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140163 |
| RPMI | Invitrogen | 22409-015 |
| Trypsin-EDTA solution | Invitrogen | 25300054 |
| Vybrant cell-labeling DiI | Lifetechnologies | 22885 |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 |
| digital color camera | Leica | DFC 340 FX |
| Digital Egg Incubator | Auto Elex Co | R-COM 50 |
| FACS | BD Biosciences | FACSAriaIII |
| Gentlemacs C-Tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 |
| Gentlemacs Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 |
| Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol | Miltenyi Biotech | |
| semipermeable adhesive film (Suprasorb F) | Lohmann&Rauscher | 20468 |
| stereo fluorescence microscope | Leica | M205 FA |
| Tissue-Tek Film automated Coverslipper | Sakura | 6400 |
| ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana Medical Systems Inc | 760-500 |
| Ventana Automated Slide Stainer | Ventana Medical Systems | Benchmark XT |
References
- Mankin, H. J., Hornicek, F. I., Rosenberg, A. E., Harmon, D. C., Gebhardt, M. C. Survival data for 648 patients with osteosarcoma treated at one institution. Clinical Orthopaedics and Related Research. 429, 286-291 (2004).
- Hoffmann, J., Schmidt-Peter, P., et al. Anticancer drug sensitivity and expression of multidrug resistance markers in early passage human sarcomas. Clinical Cancer Research. 5, 2198-2204 (1999).
- Greenlee, R. T., Hill-Harmon, M. B., Murray, T., Thun, M. Cancer statistics, 2001. CA A Cancer Journal for Clinicians. 51, 15-36 (2001).
- Gil-Benso, R., Lopez-Gines, C., et al. Establishment and characterisation of a continuous human chondrosarcoma cell line, ch-2879: Comparative histologic and genetic studies with its tumor of origin. Laboratory Investigations. 83, 877-887 (2003).
- Taylor, B. S., Barretina, J., et al. Advances in sarcoma genomics and new therpeutic targets. Nature Reviews Cancer. 11, 541-557 (2011).
- Skubitz, K. M., D’Adamo, D. R. Sarcoma. Mayo Clinic Proceedings. 82, 1409-1432 (2007).
- Nielsen, T. O., West, R. B. Translating gene expression into clinical cara: sarcomas as a paradigm. Journal of Clinical Oncology. 28, 1796-1805 (2010).
- Vaira, V., Fedele, G., Pyne, S. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107, 8352-8356 (2010).
- DeRose, Y. S., Wang, G., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).
- Tentler, J. J., Tan, A. C., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).
- Bertotti, A., Migliardi, G., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts (“xenopatients”) identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).
- Decaudin, D. Primary human tumor xenografted models (‘tumorgrafts’) for good management of patients with cancer. Anticancer Drugs. 22, 827-841 (2011).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Sys, G., Van Bockstal, M., et al. Tumor grafts derived from sarcoma patients tumor morphology, viability, and invasion potential and indicate disease outcomes in the chick chorioallantoic membrane model. Cancer Letters. 326, 69-78 (2012).
- Armstrong, P. B., Quigley, J. P., Sidebottom, E. Transepithelial invasion and intramesenchymal infiltration of the chick embryo chorioallantois by tumor cell lines. Cancer Research. 42, 1826-1837 (1982).
- Deryugina, E., Quigly, J. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130, 1119-1130 (2008).
- Knighton, D., Ausprunk, D., Tapper, D., Folkman, J. Avascular and vascular phases of tumor growth in the chick embryo. British Journal of Cancer. 35, 347-356 (1977).
- Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J. Vis. Exp. (33), e1620 (2009).
- Balke, M., Neumann, A., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Research Notes. 3, 58 (2010).
- Hendrix, A., Maynard, D., et al. Effect of the secretory small GTPase Rab27B on breast cancer growth, invasion, and metastasis. Journal of the National Cancer Institute. 102, 866-880 (2010).
- Ausprunk, D., Knighton, D., Folkman, J. Vascularization of normal and neoplastic tissues grafted to the chick chorioallantois: role of host and preexisting graft vessels. American Journal of Pathology. 79, 597-618 (1975).
- Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Riciardelli, C., Oehler, M. K. Chick Chorioallantoic membrane (CAM) Assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13, 9959-9970 (2012).
- Vargas, A., Zeisser-Labouèbe, M., Lange, N., Gurny, R., Delie, F. The chick embryo and its chorioallantoic membrane (CAM) for the in vivo evaluation of drug delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews. 59, 1162-1176 (2007).
- Hagedorn, M., Javerzat, S., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102, 1643-1648 (2005).
- De Wever, O., Hendrix, A., et al. Modeling and quantification of cancer cell invasion through collagen type I matrices. International Journal of Developmental Biology. 54, 887-896 (2010).
- Albini, A., Benelli, R. The chemoinvasion assay: A method to assess tumor and endothelial cell invasion and its modulation. Nature Protocols. 2, 504-511 (2007).
- Hanahan, D., Coussens, L. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).
