<em> В ово</em> CAM-анализа, как Xenograftmodel саркомы
Summary
<em> В ово</em> Хориоаллантоисную мембраны (CAM) прививается со свежими саркомы полученных опухолевых тканей, их одноклеточных суспензий, и постоянные и переходные флуоресцентно меченых линий установлено саркома. Модель используется для изучения трансплантат (жизнеспособность, Ki67 индекс пролиферации, некроза, инфильтрация) и хост (инфильтрация фибробластов, сосудистый врастание) поведение.
Abstract
Саркома очень редкая болезнь, которая неоднородна по своей природе, все тормозящие развитие новых методов лечения. У пациентов с саркомой являются идеальными кандидатами для персонализированной медицины после стратификации, объясняя текущую заинтересованность в развитии воспроизводимым и недорогие модели ксенотрансплантации для этого заболевания. Мембрана хорионалантоисной является естественным иммунодефицитных хозяина способны поддерживать привитых тканей и клеток без видоспецифической ограничений. Кроме того, он легко доступен, манипулировать и визуализируют с помощью оптических и флуоресценции стереомикроскопия. Гистологии в дальнейшем позволяет детальный анализ гетеротипические клеточных взаимодействий.
Этот протокол подробно описывает в ово прививки хориоаллантоисную мембраны со свежими саркомы полученных опухолевых тканей, их одноклеточных суспензий, и постоянные и переходные флуоресцентно меченых создана саркомы клеточных линий (Saos-2 и SW1353). Крыса куриных выживанияES являются до 75%. Модель используется для изучения трансплантат (жизнеспособность, Ki67 индекс пролиферации, некроза, инфильтрация) и хост (инфильтрация фибробластов, сосудистый врастание) поведение. Для локализованных прививки одноклеточных суспензий, ECM гель обеспечивает значительные преимущества по сравнению с инертными материалами сдерживания. Ki67 индекс пролиферации связано с расстоянием клеток от поверхности САМ и длительность применения на САМ, последнее определение временных рамок для того терапевтических продуктов.
Introduction
Саркома редкая опухоль соединительной ткани с высокой смертностью из-за терапии 1,2 сопротивление. Прогресс в выживаемости пациентов затрудняется их низкой ежегодной заболеваемости, их широкое разнообразие, а также тот факт, что клетки саркомы, как сообщается, трудно культуры в пробирке 3,4.
Использование культивируемых клеток на доклинической оценки терапии показали, что новый, по-видимому активных молекул в пробирке не всегда отражают результаты в клинических условиях. Кроме того, геном аберраций, выявленных массивов экспрессии генов не всегда коррелирует с опухолью характеристик поведения в отдельных пациента 5-7. Для того, чтобы попытаться решить эти проблемы, персонализированная медицина значение приобретает, которое отражается в увеличении поиск ксенотрансплантатом 8-12 моделей.
В анализе естественных условиях имеет то преимущество, отражающие сложное взаимодействие между сANCER клетками и окружающей средой ткани хозяина в солидных опухолях, необходимые для распространения рака и вторжения 13. В настоящее время изучаются использование Хорье-аллантоисных Мембрана анализа (CAM-анализ), как воспроизводимые модели ксенотрансплантата саркомы 14,15. Этот тест широко используется для изучения опухолевого ангиогенеза 16,17. В литературе, однако, мы нашли различные протоколы для этого анализа, в то время как другие исследования наблюдалось заметное различие в росте или ангиогенез в соответствии с различными протоколами 18,19.
В этой статье мы исследуем влияние изменения условий CAM-анализа на поведение клеток опухоли использованием трансплантаты, полученные из опухоли одноклеточных суспензий и сложившейся культуры клеток саркомы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Время посева и сбора урожая
Выбор времени в день прививки проводили с использованием SAOS2 в ECM гель (36 CAM) и варьировались от день эмбрионального развития 5 и 10.
До дня инкубационного 9, кулачок не был последовательно умещаются гель ECM мы применили. В период сбор…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Клетки из клеточной линии SW1353 хондросаркомой были любезно предоставлены проф PCW Hogendoorn и профессор доктор Дж. Бови Лейденского университета, Нидерланды. Мы благодарим J. Mestach и Г. Wagemans за отличную техническую помощь и Г. Де Брюйне для профессионального рисунок обзор нашего протокола.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Amaxa | VCA-1003 |
| collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640) | Sigma Aldrich | C6885 |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 |
| DMSO | Sigma | D8418 |
| Dnase solution | Sigma Aldrich | DN25 |
| G418 | Invitrogen | 11811031 |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E1270 |
| mouse primary monoclonal antibody Ki67 | Dako Denmark | MIB-1 |
| Paraformaldehyde | Fluka | D76240 |
| PBS | Invitrogen | 20012019 |
| PBSD | Invitrogen | 14040083 |
| peGFP-C1 vector | Clontech | 632470 |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140163 |
| RPMI | Invitrogen | 22409-015 |
| Trypsin-EDTA solution | Invitrogen | 25300054 |
| Vybrant cell-labeling DiI | Lifetechnologies | 22885 |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 |
| digital color camera | Leica | DFC 340 FX |
| Digital Egg Incubator | Auto Elex Co | R-COM 50 |
| FACS | BD Biosciences | FACSAriaIII |
| Gentlemacs C-Tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 |
| Gentlemacs Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 |
| Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol | Miltenyi Biotech | |
| semipermeable adhesive film (Suprasorb F) | Lohmann&Rauscher | 20468 |
| stereo fluorescence microscope | Leica | M205 FA |
| Tissue-Tek Film automated Coverslipper | Sakura | 6400 |
| ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana Medical Systems Inc | 760-500 |
| Ventana Automated Slide Stainer | Ventana Medical Systems | Benchmark XT |
References
- Mankin, H. J., Hornicek, F. I., Rosenberg, A. E., Harmon, D. C., Gebhardt, M. C. Survival data for 648 patients with osteosarcoma treated at one institution. Clinical Orthopaedics and Related Research. 429, 286-291 (2004).
- Hoffmann, J., Schmidt-Peter, P., et al. Anticancer drug sensitivity and expression of multidrug resistance markers in early passage human sarcomas. Clinical Cancer Research. 5, 2198-2204 (1999).
- Greenlee, R. T., Hill-Harmon, M. B., Murray, T., Thun, M. Cancer statistics, 2001. CA A Cancer Journal for Clinicians. 51, 15-36 (2001).
- Gil-Benso, R., Lopez-Gines, C., et al. Establishment and characterisation of a continuous human chondrosarcoma cell line, ch-2879: Comparative histologic and genetic studies with its tumor of origin. Laboratory Investigations. 83, 877-887 (2003).
- Taylor, B. S., Barretina, J., et al. Advances in sarcoma genomics and new therpeutic targets. Nature Reviews Cancer. 11, 541-557 (2011).
- Skubitz, K. M., D’Adamo, D. R. Sarcoma. Mayo Clinic Proceedings. 82, 1409-1432 (2007).
- Nielsen, T. O., West, R. B. Translating gene expression into clinical cara: sarcomas as a paradigm. Journal of Clinical Oncology. 28, 1796-1805 (2010).
- Vaira, V., Fedele, G., Pyne, S. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107, 8352-8356 (2010).
- DeRose, Y. S., Wang, G., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).
- Tentler, J. J., Tan, A. C., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).
- Bertotti, A., Migliardi, G., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts (“xenopatients”) identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).
- Decaudin, D. Primary human tumor xenografted models (‘tumorgrafts’) for good management of patients with cancer. Anticancer Drugs. 22, 827-841 (2011).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Sys, G., Van Bockstal, M., et al. Tumor grafts derived from sarcoma patients tumor morphology, viability, and invasion potential and indicate disease outcomes in the chick chorioallantoic membrane model. Cancer Letters. 326, 69-78 (2012).
- Armstrong, P. B., Quigley, J. P., Sidebottom, E. Transepithelial invasion and intramesenchymal infiltration of the chick embryo chorioallantois by tumor cell lines. Cancer Research. 42, 1826-1837 (1982).
- Deryugina, E., Quigly, J. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130, 1119-1130 (2008).
- Knighton, D., Ausprunk, D., Tapper, D., Folkman, J. Avascular and vascular phases of tumor growth in the chick embryo. British Journal of Cancer. 35, 347-356 (1977).
- Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J. Vis. Exp. (33), e1620 (2009).
- Balke, M., Neumann, A., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Research Notes. 3, 58 (2010).
- Hendrix, A., Maynard, D., et al. Effect of the secretory small GTPase Rab27B on breast cancer growth, invasion, and metastasis. Journal of the National Cancer Institute. 102, 866-880 (2010).
- Ausprunk, D., Knighton, D., Folkman, J. Vascularization of normal and neoplastic tissues grafted to the chick chorioallantois: role of host and preexisting graft vessels. American Journal of Pathology. 79, 597-618 (1975).
- Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Riciardelli, C., Oehler, M. K. Chick Chorioallantoic membrane (CAM) Assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13, 9959-9970 (2012).
- Vargas, A., Zeisser-Labouèbe, M., Lange, N., Gurny, R., Delie, F. The chick embryo and its chorioallantoic membrane (CAM) for the in vivo evaluation of drug delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews. 59, 1162-1176 (2007).
- Hagedorn, M., Javerzat, S., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102, 1643-1648 (2005).
- De Wever, O., Hendrix, A., et al. Modeling and quantification of cancer cell invasion through collagen type I matrices. International Journal of Developmental Biology. 54, 887-896 (2010).
- Albini, A., Benelli, R. The chemoinvasion assay: A method to assess tumor and endothelial cell invasion and its modulation. Nature Protocols. 2, 504-511 (2007).
- Hanahan, D., Coussens, L. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).
