Den<em> I ovo</em> Korioallantoinmembranet (CAM) ympas med färska sarkom-härledda tumörvävnad, deras enda cellsuspensioner, samt permanenta och tillfälliga fluorescerande etablerade sarkom cellinjer. Modellen används för att studera graft-(livskraft, Ki67 proliferationsindex, nekros, infiltration) och värd (fibroblast infiltration, vaskulär inväxt) beteende.
Sarkom är en mycket sällsynt sjukdom som är heterogen till sin karaktär, allt hämmar utvecklingen av nya terapier. Sarkom patienter är perfekta kandidater för personlig medicin efter stratifiering, förklarar den nuvarande intresse av att utveckla en reproducerbar och billig xenotransplantat modell för denna sjukdom. Den chick korioallantoismembranet är en naturlig immunodeficient värd kan upprätthålla ympade vävnader och celler utan artspecifika begränsningar. Dessutom är det lätt att komma åt, manipuleras och avbildas med optisk och fluorescens stereomikroskopi. Histologi tillåter även en detaljerad analys av heterotypiska cellulära interaktioner.
Detta protokoll beskriver i detalj i ovo ympning av korioallantoinmembranet med färska sarkom-härledda tumörvävnad, deras enda cellsuspensioner, samt permanenta och tillfälliga fluorescerande etablerade sarkom cellinjer (Saos-2 och SW1353). Den chick överlevnad råttaes är upp till 75%. Modellen används för att studera graft-(livskraft, Ki67 proliferationsindex, nekros, infiltration) och värd (fibroblast infiltration, vaskulär inväxt) beteende. För lokaliserad ympning av enkelcellsuspensioner, ger ECM gel betydande fördelar jämfört med inerta inneslutande material. Den Ki67 proliferationsindex är relaterad till avståndet mellan celler från ytan av CAM och varaktigheten av ansökan om CAM, den senare fastställa en tidsram för tillsättning av terapeutiska produkter.
Sarkom är en sällsynt tumör i bindväv med en hög dödlighet i terapi motstånd 1,2. Framsteg i patientens överlevnad hämmas av deras låga årliga incidensen, deras breda mångfald, och det faktum att sarkomceller rapporteras vara svårt att odling in vitro 3,4.
Användningen av odlade celler för preklinisk terapi utvärdering har visat att nya, till synes aktiva molekyler in vitro inte alltid återspeglar resultat i klinisk miljö. Dessutom genomet avvikelser avslöjas av arrayer genuttryck är inte alltid korrelerade till tumoruppförande egenskaper hos den individuella patienten 5-7. För att försöka lösa dessa problem, har personlig medicin ökat i betydelse, vilket återspeglas i den ökade sökandet efter xenograft modeller 8-12.
Ett test in vivo har fördelen av att reflektera det komplexa samspelet mellan cancer celler och värdvävnaden miljön i solida tumörer, som är nödvändiga för cancer proliferation och invasion 13. För närvarande studerar vi användningen av Chorio-allantois membrananalys (CAM-assay) som en reproducerbar xenograftmodell för sarkom 14,15. Denna analys är allmänt används för studier av tumörangiogenes 16,17. I litteraturen har vi dock funnit olika protokoll för denna analys, medan andra studier observerade en markant skillnad i tillväxt eller angiogenes enligt olika protokoll 18,19.
I denna artikel kommer vi undersöka effekten av varierande förhållanden i CAM-analys på cellens beteende med hjälp av tumör transplantat, tumörhärledda ensamstående cellsuspensioner och etablerade sarkom cellkulturer.
Tidpunkten för ympning och skörd
Timing dagen för ympning utfördes med användning SAOS2 i ECM-gel (36 CAMs) och varierade mellan embryonal utveckling dag 5 och 10.
Innan inkubation dag 9, var CAM inte konsekvent tillräckligt stor för att stödja ECM gelen vi tillämpat. Vid skörd, hade tumörceller ibland hämtas från djupare CAM, och vissa ECM gelproverna låg lös i äggvitan eller på CAM. På dag 5 och 6, var det svårt att undvika att tumörcellerna p?…
The authors have nothing to disclose.
Celler från SW1353 chondrosarcoma cellinje vänligen tillhandahållen av Prof. Dr PCW Hogendoorn och Prof. Dr J. Bovee av Leiden University, Nederländerna. Vi tackar J. Mestach och G. Wagemans för utmärkt tekniskt bistånd, och G. De Bruyne för professionell ritning av en översikt av våra protokoll.
Name of Reagent | Company | Catalog Number |
Cell Line Nucleofector Kit V | Amaxa | VCA-1003 |
collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640) | Sigma Aldrich | C6885 |
DMEM | Invitrogen | 41965-039 |
DMSO | Sigma | D8418 |
Dnase solution | Sigma Aldrich | DN25 |
G418 | Invitrogen | 11811031 |
Matrigel | Sigma-Aldrich | E1270 |
mouse primary monoclonal antibody Ki67 | Dako Denmark | MIB-1 |
Paraformaldehyde | Fluka | D76240 |
PBS | Invitrogen | 20012019 |
PBSD | Invitrogen | 14040083 |
peGFP-C1 vector | Clontech | 632470 |
Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140163 |
RPMI | Invitrogen | 22409-015 |
Trypsin-EDTA solution | Invitrogen | 25300054 |
Vybrant cell-labeling DiI | Lifetechnologies | 22885 |
Name of Equipment | Company | Catalog Number |
Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 |
digital color camera | Leica | DFC 340 FX |
Digital Egg Incubator | Auto Elex Co | R-COM 50 |
FACS | BD Biosciences | FACSAriaIII |
Gentlemacs C-Tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 |
Gentlemacs Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 |
Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol | Miltenyi Biotech | |
semipermeable adhesive film (Suprasorb F) | Lohmann&Rauscher | 20468 |
stereo fluorescence microscope | Leica | M205 FA |
Tissue-Tek Film automated Coverslipper | Sakura | 6400 |
ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana Medical Systems Inc | 760-500 |
Ventana Automated Slide Stainer | Ventana Medical Systems | Benchmark XT |