Summary
Живая съемка клеток, подвергнутых воздействию липофильном красителя FM1-43 позволяет точно определить кинетики с помощью которого порообразующие токсины удаляются из плазматической мембраны. Это чувствительным анализом, который может быть использован для оценки требований к Ca 2 +, сфингомиелиназы и других факторов на плазменной ремонта мембраны.
Abstract
Мембрана травмы плазменным является частым событием, и раны должны быть быстро восстановлены для обеспечения выживания клеток. Приток Ca 2 + является ключевым событием сигнализации, который вызывает ремонт механических ран на плазматической мембране в пределах ~ 30 сек. Недавние исследования показали, что клетки млекопитающих также запечатать их плазматическую мембрану после пермеабилизации с пор формирования токсины в Ca 2 +-зависимой процесс, который включает экзоцитоз в сфингомиелиназы лизосомальный фермент кислоты с последующим пор эндоцитоза. Здесь мы описываем методологию, используемую для демонстрации того, что Пересчет ячеек пермеабилизированных по токсин стрептолизином O также быстрое и зависит от Ca 2 + притока. Конструкция анализ позволяет синхронизировать случае травмы и точное кинетическое измерение способности клеток для восстановления целостности мембраны плазмы путем визуализации и количественного определения степени, в какой liphophilic краситель FM1-43 достигает внутриклеточных мембран. Этот живой лов анализовO позволяет чувствительным оценка способности экзогенно добавленные растворимых факторов, таких как сфингомиелиназы ингибировать FM1-43 притока, отражающий способность клеток восстанавливать их плазматической мембране. Этот анализ позволил нам показывают впервые, что сфингомиелиназы действует ниже Ca 2 +-зависимого экзоцитоза, поскольку внеклеточный добавление фермента способствует восковые колпачки с точными клеток проницаемыми в отсутствие Ca 2 +.
Introduction
Она была известна в течение нескольких десятилетий, что плазматическая мембрана ремонт после механических повреждений является Са 2 +-зависимый процесс 1,2. Более поздние исследования показали, что Са 2 + приток через рану вызывает энергичную процесс экзоцитоза внутриклеточных везикул на месте травмы, которая необходима для опечатывания 3,4. Скорость потери флуоресцентным красителем, загруженного в цитоплазме клеток использовали для оценки скорости ремонта, и пришли к выводу, что опечатывания был завершен в течение <30 сек после травмы 5. Две модели были изначально предложены для объяснения требование экзоцитоза в плазмалеммы ремонта: 1) модель "патч", который предположил, что Са 2 + приток через поражения вызывает первоначально гомотипическую слияние внутриклеточных везикул, образуя большой "патч", что бы затем применяться к плазменной мембране, чтобы запечатать рану 6 и 2) модель уменьшения напряженности, в котором предлагается, что мембраны Addeд по Ca 2 +-зависимой экзоцитоза в непосредственной близости от раны приведет к сокращению ПЛАЗМАЛЕММЫ напряжение, облегчая восковые колпачки с точными бислоя 7. Роль Ca 2 + вызвало экзоцитоза в плазме ремонта мембраны получила дальнейшее развитие в исследованиях, показывающих, что лизосомы содержат молекулу Са 2 + датчик, Synaptotagmin VII, что облегчает их экзоцитоза и плазменный ремонт мембранной в поврежденных клетках 8,9,10,11 .
Тем не менее, дополнительные доказательства показали, что в одиночку экзоцитоза не было достаточно, чтобы способствовать плазменный ремонт мембраны. В дополнение к механическим слезы на плазматической мембране, частая форма повреждения клеток является пермеабилизации по порообразующих токсинов, продуцируемых бактериями 12,13 или 14,15 иммунных клеток. В отличие от механических слез, порообразующие белки включить себя на плазматической мембране формирования стабильного белка, вдоль поры, которые не могут быть опечатана просто путем применения мембраны "заплату" или сокращеING мембраны напряжение. Интересно, что исследования показали, что клетки млекопитающих имеют эффективный механизм для восстановления их плазматическую мембрану после пермеабилизации с порообразующих белков, и этот процесс также требует присутствия внеклеточного Ca 2 + 12. Это открытие поднял вопрос о том, был также удаление трансмембранного пор от поверхности клетки быстрый процесс, как это наблюдается с механическими ран 5. Удивительно, но наши последние исследования показали, что Пересчет ячеек пермеабилизированных с порообразующих токсинов имеет очень похожие свойства ремонта механических ран: процесс требует внеклеточного Са 2 +, и завершается в течение ~ 30 сек. Исследуя этот процесс более подробно, мы недавно узнали, что в дополнение к Ca 2 +-регулируемого экзоцитоза лизосом, плазматическая мембрана ремонт включает в себя быстрое форму эндоцитоза, который срабатывает при выпуске лизосомальных ферментов кислоты сфингомиелиназу (ASM) и имеет важное значение не только для гое удаление трансмембранных пор, но и для ремонта механических ран 16.
Для определения кинетики клеток опечатывания после пермеабилизации с порообразующих белков, в нашей лаборатории мы адаптировали живой методологию формирования изображения, которая использовалась ранее для оценки восковые колпачки с точными лазерных повредил изолированных мышечных волокон 17. Этот анализ основан на использовании свойств липофильного красителя FM1-43, который стабильно встраивается в наружном листке липидных бислоев увеличением интенсивности флуоресценции. Когда плазма мембраны двухслойная нарушается прибыль внеклеточных краситель доступ к внутриклеточным мембран, обеспечивая чувствительного анализа для обнаружения плазменный травмы мембраны и ремонт 18,16,19,20. Чтобы адаптировать этот анализ для оценки клеточной проницаемости после повторной герметизации с порообразующих протеинов, мы предварительно инкубировали клетки при 4 ° С с бактериальным токсином стрептолизином O (SLO), который связывается с мембраной холестерина 21. Синхронный клетокпермеабилизации затем может быть легко достигнуто путем перемещения клетки от льда, чтобы нагреть среду в отапливаемом столике микроскопа, который активизирует олигомеризации и изменение конформации, что приводит к образованию трансмембранные пор. Преимущество этого подхода, более ранее опубликованных анализов с помощью лазерного ранения, в том, что большее число клеток могут анализироваться одновременно в микроскопической области, обеспечивая лучшую выборки клеточной популяции. Учитывая механистические сходство между процессом клеток опечатывания видел после механической травмы и проницаемости с порообразующих токсинов, анализ мы описываем здесь обеспечивает очень универсальный и мощный метод для рассечения факторы, влияющие на фундаментального процесса плазменной ремонта мембраны. В качестве примера, мы показываем, что можно использовать этот анализ для выявления Са 2 + зависимые и независимые этапы процесса ремонта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Транскрипции Подавление АНМ
- Семя 1,5 х 10 5 клеток HeLa в 2 мл питательной среды DMEM (DMEM с высоким содержанием глюкозы с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина, 1% Penn-Strep) на 35 мм со стеклянным дном посуды (Маттек) и Выдержите в течение ночи при 37 ° С в 5% СО 2 инкубатора.
- На следующий день, аспирации от питательной среде и заменить его 2 мл DMEM снижение сывороточного среде (DMEM с 4% FBS), по крайней мере, 1 ч перед добавлением трансфекции смесь миРНК.
- Подготовьте 4 трубы для миРНК олиго трансфекции смеси. В трубы А и С, добавить 250 мкл OptiMEM снижение сыворотки и 4 мкл Липофектамин RNAiMax, за 35 мм блюдо будет трансфицированной. В трубке B, добавить 250 мкл Optimem уменьшается сыворотки и 8 мкл (160 пмоль) управления средним содержанием GC олиго (управления миРНК), за 35 мм блюдо будет трансфицированной. В трубы D, добавить 250 мкл Optimem уменьшается сыворотки и 8 мкл (160 пмоль) SMPD1 олиго (siASM), за 35 мм блюдо то трансфицировать. Инкубировать пробирки при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Комбинат труб А и В, чтобы сформировать трансфекции комплекс для управления миРНК и трубки В и Г для АНМ миРНК. Инкубируйте реакции при комнатной температуре в течение 20 мин.
- Добавьте управления миРНК и ASM миРНК реакции трансфекции смеси медленно, по каплям, в соответствующие 35-мм со стеклянным дном блюда и инкубировать при температуре 37 ° C / 5% CO 2. В 24 ч после трансфекции, мягко аспирации от средств массовой информации и заменить свежей питательной среды DMEM. Для эффективного ASM нокдаун, блюда следует дополнительно инкубировали при 37 ° C / 5% CO 2 в течение примерно 31 ч (всего 55 ч) до живого изображения.
2. Подготовка реагентов для живых микроскопии
- Готовят раствор рекомбинантного порообразующий токсина стрептолизином O (SLO) в концентрации 100 нг / мкл в холодной 1x PBS без Са 2 + и Mg 2 +. СЛО используется в этих анализах является constitutivelу активным цистеин мутант, который не требует восстановителей для деятельности, любезно предоставлены доктором Родом Tweten, Университет Оклахомы. Было высказано токсин в E. палочка BL21 DE3 и очищали при нативных условиях, как описано выше 16.
- Подготовьте исходный раствор FM1-43: Ресуспендируйте FM1-43 лиофилизированный порошок в ДМСО, чтобы создать решение 25 мм.
- Подготовка Раствор А: Развести FM1-43 маточного раствора в холодную DMEM с Са 2 + в конечной концентрации 4 мкМ (1,5 мл необходимых в Маттек блюдо) и хранить на льду до использования.
- Получают раствор B: Развести FM1-43 маточного раствора в холодную DMEM без Ca 2 + и 10 мМ EGTA (Са 2 +-свободный DMEM) до конечной концентрации 4 мкМ (1,5 мл, необходимые в Маттек блюдо) и хранить на льду до необходимости.
- Предварительно теплой (37 ° С) 1 мл аликвоты раствора А и раствора В в пробирки Эппендорфа.
- Держите на льду решений DMEM с Ca 2 +, и C2 + без DMEM.
3. Живых изображений сотовый из FM1-43 приток в SLO обработанных и необработанных клеток
- Заполните размер среднего мелкий металлический контейнер с колотым льдом, инвертировать его в большой стеклянной таре со льдом и добавить дополнительный лед оставив только нижнюю поверхность металлического контейнера подвергается. Наведите влажное бумажное полотенце на открытой металлической нижней части, чтобы позволить даже термотрансферной.
- Возьмите одну Контроль миРНК обработанной Маттек блюдо (образец 1) и поместите его на холодном мокром бумажном полотенце. Осторожно аспирации от всех средств массовой информации и промыть 3 раза с холодной Ca 2 + свободного DMEM. После последней промывки, аспирация от всех средств массовой информации в блюдо.
- Чтобы изображение клеток связано FM1-43 в клетках, не имеющих SLO ранения (образец 1) в присутствии Са2 +, добавьте 180 мкл холодного раствора B в центр покровным стеклом 35-мм со стеклянным дном тарелки и инкубировать в течение 5 мин на льду (табл. 1). Наведите Маттек блюдо на сцене конфокальной микроскопии, нагретой до 37 ° С и оснащены камере искусственного климата (который поддерживает температуру, влажность и со 2 уровня). Найдите поле ячеек, которые будут отображаемого глядя через 40X NA 1.3 объектива (Nikon). Если возможно, включать PerfectFocus или аналогичного устройства для коррекции температурного дрейфа.
- Добавить 1 мл предварительно нагретого раствора А осторожно в сторону 35-мм чашку и заменить крышку климатическую камеру (табл. 1).
- Получение изображений для 4 мин со скоростью 1 кадр каждые 3 секунды с помощью соответствующего программного обеспечения обработки изображений (Volocity в UltraView Vox Perkin Elmer вращающийся диск конфокальной микроскопии системы). Возбуждение FM1-43 осуществляется с 488 нм лазерной линии с помощью дихроичный фильтр с перевала в 488 нм полосы, и дискриминация выбросов достигается за счет использования фильтра с 527 (W55) излучения. Уровни мощности лазера и чувствительность камеры установлены для достижения воздействия Изображение 100 мс.
- Повторите этапы от 3,2 до 3,6, чтобы обнаружить FM1-43 в контрольной миРНК-обработанных клеток, не SLO ранения (образец 2) в отсутствие Са2 +, за исключением того, что на шаге 3.5 Раствор B должны быть добавлены (табл. 1).
- Для измерения FM1-43 приток в управления миРНК-обработанных клеток раненых с SLO либо в присутствии (образец 3) или в отсутствие Са2 + (образец 4), добавьте 180 мкл холодного раствора B, содержащих SLO в центр покровным стеклом из 35-мм со стеклянным дном блюдо и выдержать в течение 5 мин на льду, как в шаге 3.3. Повторите шаги 3,2 через 3,6; настроить добавления или решения А или Устранение B на шаге 3.5 (табл. 1).
- Для определения роли АНМ в плазме ремонта мембраны, повторите шаги 3.2-3.6 используя ASM миРНК обработанных клеток для всех условий (образцы 5-8) (табл. 1).
- Для определения роли внеклеточной рекомбинантного сфингомиелиназы (SM) наКинетика плазмы ремонта мембраны (отраженные от торможения в FM1-43 притока) (образцы 9-10), SM добавляется (0-50 мкЕд) либо раствор или раствор B на шаге 3.5 и затем добавляли к клеткам в течение живой клетке изображений в общем объеме 1 мл (табл. 1).
4. Количественная оценка FM1-43 приток в клетках
- После фильмов были приобретены, измерения внутриклеточной интенсивности флуоресценции FM1-43 с помощью анализа изображений программное обеспечение (Volocity Люкс, PerkinElmer). Нарисуйте область интереса в цитозольной области каждой ячейки в области и применять программные средства для определения среднего FM1-43 интенсивность флуоресценции всей всех кадрах видео.
- Для регулировки вариации в начальной FM1-43 окрашивания, данные для каждого видео выражается как кратное увеличение интенсивности флуоресценции с течением времени, и нанесены для каждого отдельного состоянии. Кратное увеличение флуоресценции каждой отдельной временной точке вклеток рассчитывается как F T / F 0, где F T является среднее флуоресценции в конкретной временной точке, и F 0 является средним флуоресценции при Т = 0 (рисунки 1-2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Низкие концентрации бактериальной сфингомиелиназы (SM) спасательные плазмы мембраны ремонта в клетках обедненных сфингомиелиназы лизосомальных кислоты.
Использование FM1-43 формирования изображения анализа, ранее мы показали, что клетки с дефицитом для лизосомальных ферментов АНМ и воздействию SLO ранение в присутствии Ca 2 + у плазматической мембраны дефект спасает внеклеточного добавлением рекомбинантного человеческого фермента 19. Так как человеческий лизосомальный ASM имеет оптимум рН низкое, мы исследовали, может ли повторной герметизации также может быть восстановлен добавлением SM очищенный от Bacillus сегеиз (Sigma), который полностью активны при нейтральном рН. Как было показано ранее, клетки, обработанные контрольной киРНК или ASM миРНК олигонуклеотидов и воздействию SLO в отсутствие Са2 + (условия не разрешающие для ремонта) были в равной степени проницаемыми, показывая, что истощение ASM не мешает чувствительности к токсину (рис. 1А ). Интересно, что полный спасательные ое способность ASM-дефицитных клеток запечатать после воздействия SLO наблюдалось при низких концентрациях SM, 5 и 7,5 мкЕд / мл (рис. 1b). Как концентрация фермента добавляли в среду вырос, была постепенная потеря в фенотипе спасательной - клетки подвергаются до 10 мкЕд / мл лишь частично перекрыли приток FM1-43 после воздействия SLO, и клетки подвергаются до 50 мкЕд / мл показали сильный приток краситель картина, отражающая полный дефект опечатывания аналогичную той, которая наблюдается в АНМ обедненного клетки (рис. 1б и 1в). Этот результат показывает, что эндоцитотический удаление SLO поры жестко регулируется уровней церамидных генерируемых в плазматической мембране СМ - выше определенного уровня процесс не происходит, как правило, и клетки не могут удалить поражений.
Сфингомиелиназы дополнение обходит потребность в Са 2 + в плазме ремонта мембраны.
Примечательно, что добавление бактериальной SМ к клеткам пермеабилизированных по SLO в отсутствие Ca 2 + (обычно условия, которые не позволяют клеток Пересчет) также спасли плазмы ремонт мембраны. Как видно из клеток, подвергнутых воздействию порообразующего токсина в присутствии Са 2 + (фиг. 1B и 1C), только низкие концентрации СМ были эффективны в блокировании приток FM1-43 (фиг.2А и 2В). Эти результаты показывают, что сфингомиелиназы функции вниз по течению от Ca 2 +-зависимой стадии плазменного ремонта мембраны. Этот вывод полностью согласуется с нашей ранее предложенной модели, в которой постулируется, что Са 2 +, протекающий через трансмембранных пор вызывает экзоцитоза лизосом и ASM-релизе, который расщепляет сфингомиелин на наружный листок плазматической мембраны, генерируя церамида и способствуя удалению пор по эндоцитоза 22 , 19. Тот факт, что добавление очищенной SM обходит потребность в Ca2 + сильно усилитьс мнение, что в физиологических условиях Ca 2 +-регулируемых экзоцитоза лизосом является источником сфингомиелиназы деятельности, необходимой для продвижения эндоцитоз.
Рисунок 1. Bacillus Cereus сфингомиелиназы (SM) могут дополнить плазмы ремонта мембрана дефект клеток глушителем для экспрессии кислоты сфингомиелиназы (ASM) рану от порообразующего токсина стрептолизином O (SLO). HeLa клетки, обработанные контрольной киРНК или ASM миРНК олигонуклеотидов были ранены в отсутствии или в присутствии Са 2 + и притока липофильном красителя FM1-43 был сфотографирован на 1 кадр / 3 сек в течение 4 мин. FM1-43 внутриклеточный флуоресценции количественно, используя программное обеспечение Volocity и выражены как кратное увеличение интенсивности флуоресценции с течением времени. (A) В отсутствие Ca 2 +, как контроль миРНК и ASM миРНК-Обработанные клетки проницаемыми по SLO. 18-27 клетки анализировали в каждом состоянии;. Планки погрешностей соответствуют среднее + / - SEM (б) в присутствии ионов Са 2 +, клетки, обработанные контрольной киРНК смогли запечатать их плазматической мембраны и остановить приток красителя, в то время клетки, обработанные ASM миРНК удалось запечатать. Кроме того, в присутствии ионов Са 2 +, экзогенный добавление малых доз сфингомиелиназы дополняет плазматической мембране дефект ASM миРНК-обработанных клеток. 18-62 клетки анализировали в каждом состоянии; планки погрешностей соответствуют среднему + / - SEM (C) Выбранный временные рамки фильма анализируемого в B.. Бары, 9 мкм. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
г "альт =" Рисунок 2 "FO: контент-ширины =" 3.25in "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50531/50531fig2highres.jpg "/>
Рисунок 2. Сфингомиелиназы дополнение обходит потребность в Са 2 + в плазме ремонта мембраны. HeLa клетки, обработанные управления миРНК были ранены с SLO в отсутствие Ca 2 + и приток липофильном красителя FM1-43 был сфотографирован на 1 кадр / 3 сек на 4 минимум FM1-43 внутриклеточный флуоресценции количественно, используя Volocity программное обеспечение и выражается как кратное увеличение интенсивности флуоресценции с течением времени. (А) Отсутствие мембране распечатывания обычно видели в клетках, пострадавших в результате SLO в отсутствие Ca 2 + восстанавливается с экзогенной того низких доз сфингомиелиназы. 18-31 клетки анализировали в каждом состоянии; планки погрешностей соответствуют среднему + / - SEM (В) Выбранный временные рамки фильма анализируемого в.. Бары, 9 мкм.g2large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок.
Рисунок 3. Процедура сроки. Срок экспериментальных шагов, участвующих в процедуре. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
| Ca 2 +-состояние | Ca 2 +-свободном состоянии | СЛО токсин | Теплый раствор А | Теплый раствор В | Сфингомиелиназы | Шаг |
| + | - | - | + | - | - | 3.2 |
| - | + | - | - | + | - | 3.7 |
| + | - | + | + | - | - | 3.8 |
| - | + | + | - | + | - | 3.8 |
| + | - | - | + | - | - | 3.9 |
| - | + | - | - | + | - | 3.9 |
| + | - | + | + | - | - | 3.9 |
| - | + | + | - | + | - | 3.9 |
| - | + | + | - | + | + | 3.10 |
| + | - | + | + | - | + | 3.10 |
Таблица 1. Состав растворов, используемых в экспериментальной процедурой. Образцы, описанные в процедуре приведены в строках. Колонны обозначают присутствие (+) или отсутствие (-) от имени компонента (олиго, Ca 2 + или Ca 2 +-среде без, SLO, раствора А или В, сфингомиелиназы). Экспериментальные стадии, в которых эти образцы сначала используются для работы с изображениями живых клеток в процессуальном разделе 3 указываются.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Более ранние исследования на механической травмы и плазмалеммы ремонта полагались на различных механизмов, вредящих клеток, начиная от падения стеклянные бусы, micropipetting, отрезные, царапин или выскабливание. Показания всех этих анализов была качественной, а не количественной, а не дать точную информацию о кинетики механизма восстановления. Способность клеток запечатать их плазматическую мембрану после этих форм травмы измерялась наличия или отсутствия индикаторов, добавленных к внеклеточной жидкости в цитоплазме, проникновения мембранных непроницаемых красителей, потери цитозольными ферментов, уровня АТФ, или долгосрочной перспективе сотовой выживание. Хотя некоторые из этих анализов могут быть выполнены количественно, один из основных препятствий в этих исследованиях была трудность в синхронизации ранения событие, а быстрой оценки кинетики повторной герметизации на уровне одной клетки.
Развитие и использование УФ-лазера травмы мышечных волокон Фоллово главе с обнаружения притока липофильном красителя FM1-43 был важным шагом вперед в этих исследованиях 17,20. Вместо валового ущерб, причиненный всей клеточной популяции, очищая похожих механические средства травмы, эти анализы представила более определенный способ заживления клетки, которые позволили анализ одной клетки. Тем не менее, несколько проблем, оставались в таких анализах. Размер лазерно-индуцированных поражений большой и довольно варьируется в зависимости от интенсивности лазерного излучения, и очень разные по своей природе, чем формы травмы мембраны, которые происходят во физиологических условиях. Еще одна проблема в том, что только в одной ячейке или мышечное волокно может быть ранен в тот момент, используя микроскоп связанных лазеров, сокращение численности опечатывания события, которым можно следовать, и, таким образом статистическая значимость полученных результатов. Эти проблемы с воспроизводимостью и отбора проб значительно снижается полезность лазерной травмы в качестве метода для исследования механизмов плазмы ремонта мембраны.
То решать эти вопросы, мы разработали новую анализа изображений живых клеток, чтобы точно измерить ремонт кинетики плазмы мембранных повреждений, вызванных бактериальными порообразующих токсинов. Это является одной из форм травм, которые часто встречается в природе, так как многие микроорганизмы обладают многочисленными токсины, которые способны permeabilizing мембрану эукариотических клетках. Этот анализ может быть точно синхронизированы путем предварительной инкубации клеток с токсином при низких температурах, а также позволяет большое количество клеток в микроскопической области должны быть проанализированы для притока FM1-43, а температуру повышают, чтобы вызвать образование пор.
Точной синхронизации порообразования достигается при данном анализе позволяет воспроизводимых измерений плазмы ремонтных мембрана кинетики, который может быть количественно одновременно в нескольких отдельных клеток в поле микроскопа. Один важный технический фактором в этих анализах, является качество микроскопа объектива, который будет использоваться для работы с изображениями. Тон 40X NA 1,3 (Nikon) цель, используемый в наших анализах, позволяет в достаточной выборки клеток в популяции без потери разрешения изображения. Переключение на цели 10X позволит большую выборку популяции клеток, но разрешение, что достигается недостаточно для правильного количественного внутриклеточного FM1-43. Важным шагом на этой живой анализа изображений клетка является использование PerfectFocus или аналогичного устройства для коррекции температурного дрейфа. Наша процедура требует предварительного связывания бактериального порообразующего токсина в клетки на льду, а затем перенос температуру быстро до 37 ° С в течение изображений живых клеток. Это регулировка температуры вызовет осевые колебания фокус в период захвата изображений, и должны быть исправлены. PerfectFocus или аналогичное устройство будет исправить эту проблему, позволяя жить ячейки изображения выбранного фокальной плоскости в течение длительного периода времени, что позволяет точную количественную из плазмы ремонтных мембрана кинетики.
Ключ кУспех этого анализа является всегда титр различные концентрации предварительного формирования токсина, чтобы определить, ремонту и ремонту не подлежат дозы, так как это может варьироваться для каждой партии токсина используется. Деятельность многих токсинов, и SLO в частности, является чувствительным к температуре и несколько стоп-тает циклы вредны для его деятельности. Тем не менее, титрование, проведенные вместе в каждом эксперименте позволит правильный доза токсина, чтобы быть точно определены лишь в нескольких минутах от покадровой обработки изображений.
Этот анализ основан на обнаружении достаточного внутриклеточной флуоресценции FM1-43 после травмы плазматической мембраны. Это может быть ограничение при определенных условиях. После вставки в мембраны SLO формы поры с диаметром около 30 нм, что обеспечивает надежную Ca 2 + притока и быстрое реагирование плазмы ремонта мембрана в эукариотических клетках. Тем не менее, порообразующий токсины, которые формируют меньшие повреждения, такие как aerolysin и lysenin которые имеют поры диаметром около1-3 нм 23-25 не может быть адекватным для этого анализа, так как они могут привести к недостаточному Са 2 + и FM1-43 притока.
Даже при использовании токсин, который генерирует большие поры, такие как SLO, важно иметь в виду, что эта визуализация анализ не позволяет абсолютного количественного определения интенсивности флуоресценции, а относительная флуоресценции. Таким образом, очень важно, чтобы изображения не производится в внутрикадровым динамическим диапазоном цифровыми камерами. Так как интенсивность флуоресценции зависит от мощности лазера, время экспозиции, и увеличение камеры, важно установить эти три параметра в начале каждого эксперимента путем выполнения предварительного визуализации клеток, обработанных FM1-43 и SLO как в ремонте и Non -ремонт условия (Са 2 + или Са 2 + без среднего). Это позволяет выбор настроек захвата изображений, которые позволяют обнаруживать флуоресценции в нулевой момент времени (до SLO того), но не приводят к насыщению детектора (как DETERMINED на программное обеспечение считывания) в конце приобретения в условиях не-ремонта.
С помощью этого анализа, мы смогли продемонстрировать, что SLO поры будут удалены из плазматической мембраны клетки млекопитающих менее чем за 30 сек, демонстрируя, что этот процесс имеет быструю кинетику, аналогичные ремонта механических ран 16. Последующие исследования показали, что энзим лизосомальных ASM требуется для плазменной мембраны ремонта и способен восстановить повторной герметизации при добавлении внеклеточно в ASM-дефицитных клеток 19. В настоящем исследовании, мы воспользовались чувствительности приток анализа FM1-43, чтобы показать, в первый раз, что плазма ремонт мембрана может также произойти в отсутствие внеклеточного Ca 2 +. Выдержка из раненых клеток рекомбинантного сфингомиелиназы было достаточно, чтобы способствовать повторной герметизации в клетках пермеабилизированных по SLO в Ca 2 + бесплатная среднего, состояние обычно не разрешительный для плазменной ремонта мембраны. Интересно, дополняютлизации мощности плазменной мембраны ремонта не наблюдалось после воздействия высоких концентраций сфингомиелиназы, предполагая, что количество церамида, генерируемого этого фермента на внешней листок плазматической мембраны является важным фактором, определяющим процесс удаления поражение. Это открытие показывает, что Ca 2 + необходимо инициировать шаг лизосомальных экзоцитоза, но не требуется для сфингомиелиназы-индуцированной эндоцитоза, который отвечает за раны интернализации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NIH гранты R37 AI34867 и R01 GM064625 в NWA Мы благодарим доктора Р. Tweten из Университета Оклахомы для плазмиды экспрессии SLO.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| HeLa 229 cell line | ATCC | CCL2-1 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | 11965 | |
| DMEM High Glucose No Calcium | Invitrogen | 20168 | |
| FM1-43 | Invitrogen | T3163 | |
| Optimem Reduced Serum | Invitrogen | 31985 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778 | |
| Control medium GC content RNAi oligo | Invitrogen | 12935300 | |
| SMPD1 RNAi oligo | Invitrogen | HSS143988 | |
| Fetal Bovine Serum Heat-inactivated | Gemini-Bioproducts | 100-106 | |
| Sphingomyelinase from Bacillus cereus | Sigma | S7651 | |
| 35 mm-glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-14 | |
| Material | |||
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Camera | Hamamatsu Photonics | C9100-50 | |
| Spinning disk confocal microscope | PerkinElmer | UltraViewVoX | |
| Software analysis software | PerkinElmer | Volocity Suite | |
| Environmental chamber | Pathology Devices | LiveCell System Chamber | |
References
- Heilbrunn, L. The dynamics of living protoplasm. , Academic Press. (1956).
- Chambers, R., Chambers, E. Explorations into the nature of the living cell. , Harvard University Press. (1961).
- Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. J. Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).
- Miyake, K., McNeil, P. L. Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption. J. Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).
- Steinhardt, R. A., Guoqiang, B., Alderton, J. M. Cell membrane resealing by a vesicular mechanism similar to neurotransmitter release. Science. 263, 390-393 (1994).
- McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane. J. Cell Sci. 113, 1891-1902 (2000).
- Togo, T., Alderton, J. M., Bi, G. Q., Steinhardt, R. A. The mechanism of facilitated cell membrane resealing. J. Cell Sci. 112, 719-731 (1999).
- Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. J. Cell Biol. 137, 93-104 (1997).
- Reddy, A., Caler, E., Andrews, N. Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
- Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. J. Cell Biol. 159, 625-635 (2002).
- Chakrabarti, S., et al. Impaired membrane resealing and autoimmune myositis in synaptotagmin VII-deficient mice. J. Cell Biol. 162, 543-549 (2003).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).
- Iacovache, I., van der Goot, F. G., Pernot, L. Pore formation: an ancient yet complex form of attack. Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1611-1623 (2008).
- Morgan, B. P., Campbell, A. K. The recovery of human polymorphonuclear leucocytes from sublytic complement attack is mediated by changes in intracellular free calcium. Biochem. J. 231, 205-208 (1985).
- Keefe, D., et al. Perforin triggers a plasma membrane-repair response that facilitates CTL induction of apoptosis. Immunity. 23, 249-262 (2005).
- Idone, V., et al. Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis. J. Cell Biol. 180, 905-914 (2008).
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
- McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).
- Tam, C., et al. Exocytosis of acid sphingomyelinase by wounded cells promotes endocytosis and plasma membrane repair. J. Cell Biol. 189, 1027-1038 (2010).
- Weisleder, N., et al. Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems. J. Vis. Exp. (52), e2717 (2011).
- Tweten, R. K. Cholesterol-dependent cytolysins, a family of versatile pore-forming toxins. Infect. Immun. 73, 6199-6209 (2005).
- Zha, X., et al. Sphingomyelinase treatment induces ATP-independent endocytosis. J. Cell Biol. 140, 39-47 (1998).
- Buckley, J. T. Crossing three membranes. Channel formation by aerolysin. FEBS Lett. 307, 30-33 (1992).
- Parker, M. W., et al. Structure of the Aeromonas toxin proaerolysin in its water-soluble and membrane-channel states. Nature. 367, 292-295 Forthcoming.
- Yamaji-Hasegawa, A., et al. Oligomerization and pore formation of a sphingomyelin-specific toxin, lysenin. J. Biol. Chem. 278, 22762-22770 (2003).
