CA의 역할을 평가하기위한 영상 분석을 라이브<sup> 2 +</sup기공 형성 독소 상처의 수리에>와 Sphingomyelinase
Summary
친 유성 염료 FM1-43에 노출 된 세포의 라이브 영상은 기공 형성 독소는 세포막에서 제거되는 반응 속도의 정밀한 결정을 허용한다. 이것은 CA에 대한 요구 사항이 +, sphingomyelinase 및 세포막 수리 및 다른 인자를 평가하는 데 사용될 수있는 민감한 분석이다.
Abstract
세포막 손상은 빈번한 이벤트이며, 상처는 빠르게 세포의 생존을 보장하기 위해 복구해야 할. 칼슘 2 +의 유입은 30 초 ~ 내의 세포막에 기계적인 상처의 수리를 트리거 키 신호 이벤트입니다. 최근의 연구는 포유 동물 세포는 또한 기공은 기공 엔도 시토 시스 뒤에 리소좀 효소 산 sphingomyelinase의 세포 외 유출을 포함하는 칼슘 2 +에 의존하는 과정에서 독소를 형성하는 permeabilization 후 자신의 세포막을 봉인 것으로 나타났다. 여기, 우리는 독소 streptolysin의 O에 의해 permeabilized 세포의 재 밀봉이 칼슘 2 + 유입에도 신속하고 종속이 있음을 입증하는 데 사용되는 방법을 설명합니다. 분석 설계는 허용 부상 이벤트의 동기화 및 촬상하여 세포막 무결성을 복원하고 liphophilic 염료 FM1-43 세포의 세포막에 도달하는 정도를 정량화하는 세포의 능력의 정확한 운동 측정. 이 라이브 분석 ALSO는 외생의 능력의 중요한 평가들이 세포막을 복구하는 세포의 능력을 반영 FM1-43의 유입을 억제하는 등 sphingomyelinase 같은 가용성 인자를 첨가한다. 이 분석은 우리가 효소의 세포 또한이 칼슘 2 +의 부재에서 permeabilized 세포의 재 밀봉을 촉진하기 때문에 sphingomyelinase, 캘리포니아 2 +에 의존하는 세포 외 유출의 하류 역할을하는 것이 처음으로 보여줄 수있었습니다.
Introduction
그것은 기계적인 손상 후 세포막 수리 칼슘 2 +에 의존하는 프로세스 1,2 것을 수십 년 동안 알려져있다. 나중에 연구는 상처를 통해 칼슘 2 +의 유입이 3,4 재 밀봉에 필요한 부상의 사이트에서 세포 내 소포의 세포 외 유출의 활발한 프로세스를 트리거 것으로 나타났다. 세포의 세포질에로드 형광 염료의 손실의 비율은 수리의 속도를 평가하는 데 사용하고, 재 밀봉이 손상 후 5 <30 초 이내에 완료되었다는 결론을 내렸다. 두 모델은 처음에 플라즈마 막 수리의 세포 외 유출에 대한 요구 사항을 설명하기 위해 제안했다 : 병변을 통해 칼슘 2 + 유입이 큰 "패치"를 형성, 세포 내 소포의 초기 호모 융합을 트리거 것을 제안 1) "패치"모델을하는 것 그 다음 상처 6 및 그 막 Adde 5의 제안 2) 장력 감소 모델을 봉인하는 세포막에 적용될상처의 근처에서 칼슘 2 + 의존성 세포 외 유출 d 개의 이중층 (7)의 재 밀봉을 용이하게 세포막 의욕을 감소시킬 것이다. 세포막 수리 칼슘 2 + 트리거 세포 외 유출의 역할은 상기 리소좀가 손상균 그들의 세포 외 유출 및 세포막 보수를 용이 칼슘 2 + 센서 분자 synaptotagmin VII 포함될 것을 보여주는 연구에 의해 보강되었다 8,9,10,11 .
그러나, 추가 증거만으로는 세포 외 유출이 세포막의 복구를 촉진하기에 충분하지이라고 지적했다. 원형질막에 기계적 눈물 이외에, 세포 상해의 빈번한 형태는 박테리아 12,13 또는 14,15 면역 세포에 의해 생성 된 기공 형성 독소 permeabilization이다. 기계적 눈물 달리 기공 형성 단백질은 세포막은 막을 "패치"를 적용함으로써 또는 현상 감소하여 단순히 재 밀봉 할 수없는 안정한 단백질 늘어선 기공 형성에 자신을 삽입막 긴장을 보내고. 흥미롭게 연구는 포유 동물 세포는 기공 형성 단백질과 permeabilization 후 자신의 세포막을 복구하는 효율적인 메커니즘을 가지고 있고,이 프로세스는 또한 세포 외 칼슘 2 + (12)의 존재를 필요로 것으로 나타났다. 기계적인 상처 (5)와 관찰이 발견은 세포 표면에서 횡단 기공 제거도 빠른 처리 여부의 문제를 제기했다. 과정은 칼슘 2 + 세포 필요로하고, 30 초 ~ 이내에 완료된다 놀랍게도, 우리의 최근의 연구는 기공 형성 독소 permeabilized 세포의 재 밀봉 기계적인 상처의 수리와 매우 유사한 특성을 가지고 것으로 나타났습니다. 이 과정을 자세히 조사하고, 우리는 최근 리소좀의 칼슘 2 + 규제 세포 외 유출뿐만 아니라, 세포막 수리 산 sphingomyelinase (ASM)을 효소 리소좀의 릴리스에 의해 트리거 필수입니다 엔도 사이토 시스의 빠른 형태를 포함 것을 알게 뿐만 아니라 일에 대한횡단 모공 전자의 제거뿐만 아니라, 기계적인 상처 (16)의 수리.
기공 형성 단백질과 permeabilization 후 세포 재 밀봉의 반응 속도를 결정하기 위해, 우리의 실험실에서 우리는 레이저 부상 고립 된 근육 섬유 (17)의 재 밀봉을 평가하기 위해 이전에 사용했던 라이브 영상 방법론을 적용. 이 분석은 안정적으로 형광 강도가 증가하고 지질 이중층의 외부 전단지에 인 인터 친 유성 염료 FM1-43의 특성에 의존한다. 세포막 이중층은 세포막의 손상을 감지하고 18,16,19,20를 복구하는 중요한 분석을 제공, 세포 내 세포막 세포 염료 이익 액세스 중단됩니다. 기공 형성 단백질과 permeabilization 후 세포 재 밀봉의 평가에이 분석을 적용하기 위해, 우리는 막 콜레스테롤 (21)에 결합하는 세균성 독소 streptolysin의 O (SLO), 4 ° C에서 세포를 미리 배양 하였다. 동기 셀permeabilization 후 쉽게 기공 형성을 횡단하는 형태의 리드 올리고머 및 변경을 활성화하는 가열 현미경 스테이지에서 매체 가온 얼음에서 세포를 이동시킴으로써 달성 될 수있다. 이 방법의 장점은, 레이저 상흔을 사용 이전에 발행 된 분석법을 통해, 셀들의 많은 수는 세포 집단의 더 나은 샘플링을 제공 현미경 분야에서 동시에 분석 될 수 있다는 점이다. 기공 형성 독소 기계적 손상과 permeabilization 후 본 셀 재 밀봉 공정의 기계적인 유사성을 감안할 때, 우리가 여기서 설명하는 분석은 세포막 수리의 기본 과정에 참여 요인을 해부에 매우 다양하고 강력한 방법을 제공한다. 예로서, 우리는 복구 프로세스의 칼슘 2 + 종속 독립 단계를 식별하는이 분석을 사용하는 것이 가능하다는 것을 보여준다.
Protocol
Representative Results
Discussion
기계 손상 및 세포막 수리에 대한 이전 연구는 유리 구슬, micropipetting, 전단, 긁거나 긁는을 삭제에 이르기까지, 손상 세포의 다양한 메커니즘에 의존했다. 이러한 분석법의 판독 오히려 정량보다 질적이고, 수리기구의 동역학에 정확한 정보를 제공하지 않았다. 부상 이러한 형태 후 자신의 원형질막을 봉인하는 세포의 능력은 세포막 투과성 염료, 세포질 효소 ATP 수준 또는 장기의 손실의 세포질 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 우리가 SLO 발현 플라스미드 오클라호마 대학에서 박사 R. Tweten 감사 NWA에 NIH 보조금 R37 AI34867 및 R01 GM064625에 의해 지원되었다.
Materials
| Reagent | |||
| HeLa 229 cell line | ATCC | CCL2-1 | |
| DMEM High Glucose | Invitrogen | 11965 | |
| DMEM High Glucose No Calcium | Invitrogen | 20168 | |
| FM1-43 | Invitrogen | T3163 | |
| Optimem Reduced Serum | Invitrogen | 31985 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Invitrogen | 13778 | |
| Control medium GC content RNAi oligo | Invitrogen | 12935300 | |
| SMPD1 RNAi oligo | Invitrogen | HSS143988 | |
| Fetal Bovine Serum Heat-inactivated | Gemini-Bioproducts | 100-106 | |
| Sphingomyelinase from Bacillus cereus | Sigma | S7651 | |
| 35 mm-glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-14 | |
| Material | |||
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Camera | Hamamatsu Photonics | C9100-50 | |
| Spinning disk confocal microscope | PerkinElmer | UltraViewVoX | |
| Software analysis software | PerkinElmer | Volocity Suite | |
| Environmental chamber | Pathology Devices | LiveCell System Chamber |
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