Vivere Imaging test per la valutazione dei ruoli di Ca^{2 +} E sfingomielinasi nella riparazione di Pore-formano ferite Tossina

Summary

Vivo imaging di cellule esposte al colorante lipofilo FM1-43 consente una determinazione precisa della cinetica con cui tossine formanti pori vengono rimossi dalla membrana plasmatica. Questo è un test sensibile che può essere utilizzato per valutare requisiti di Ca ^{2 +,} sfingomielinasi e altri fattori sulla membrana plasmatica di riparazione.

Abstract

Lesione della membrana plasmatica è un evento frequente, e le ferite devono essere rapidamente riparato per garantire la sopravvivenza cellulare. Afflusso di Ca ^{2 +} è un evento chiave di segnalazione che attiva la riparazione di ferite meccaniche sulla membrana plasmatica entro ~ 30 sec. Recenti studi hanno rivelato che le cellule di mammifero anche richiudersi loro membrana plasmatica dopo permeabilizzazione con formazione di pori tossine in un processo ^{2 +-dipendente} Ca che coinvolge esocitosi della sfingomielinasi acida lisosomiale seguita da pori endocitosi. Qui, descriviamo la metodologia utilizzata per dimostrare che la richiusura delle cellule permeabilizzate dalla tossina streptolisina O è anche un rapido e dipendente da Ca ^{2 +} afflusso. Il design saggio permette la sincronizzazione dell'evento lesioni e una misurazione cinetica precisa della capacità delle cellule di ripristinare l'integrità della membrana plasmatica mediante imaging e quantificare la misura in cui il colorante liphophilic FM1-43 raggiunge membrane intracellulari. Questo live als testO consente una valutazione sensibile della capacità di esogenamente aggiunto fattori solubili quali sphingomyelinase inibire FM1-43 afflusso, riflettendo la capacità delle cellule di riparazione sulla membrana plasmatica. Questa analisi ha permesso di mostrare per la prima volta che sphingomyelinase agisce a valle di Ca ^{2 +-dipendente} esocitosi, poiché extracellulare aggiunta dell'enzima promuove richiusura delle cellule permeabilizzate in assenza di Ca ^{2 +.}

Introduction

E 'noto da diversi decenni riparazione della membrana plasmatica dopo una lesione meccanica è un ^1,2 Ca ^{2 +-dipendente} processo. Studi successivi hanno mostrato che Ca ^{2 +} afflusso attraverso la ferita innesca un vigoroso processo di esocitosi di vescicole intracellulari al sito della lesione, che è richiesto per richiusura ^3,4. Il tasso di perdita di un colorante fluorescente caricato nel citoplasma delle cellule è stato utilizzato per valutare la velocità di riparazione, concludendo che richiusura è stato completato entro <30 sec dopo la lesione ^5. Due modelli sono stati inizialmente proposti per spiegare il requisito di esocitosi nella riparazione membrana plasmatica: 1) il modello "patch", che suggerisce che Ca ^{2 +} afflusso attraverso la lesione innesca fusione inizialmente omotipica di vescicole intracellulari, formando una grande "patch" che sarebbe poi essere applicato alla membrana plasmatica di richiudere la ferita ⁶ e 2) il modello di riduzione della tensione, che propone di membrana Added entro Ca ^{2 +-dipendente} esocitosi in prossimità della ferita ridurrebbe tensione della membrana plasmatica, facilitando richiusura del doppio strato ^7. Il ruolo di Ca ^{2 +-triggered} esocitosi nel plasma di riparazione della membrana è stata ulteriormente rafforzata da studi che dimostrano che i lisosomi contengono una molecola di Ca ^{2 +} sensore, synaptotagmin VII, che facilita il loro esocitosi e plasma riparazione della membrana in cellule danneggiate ^8,9,10,11 .

Tuttavia, ulteriori elementi di prova ha indicato che solo esocitosi non era sufficiente a promuovere la riparazione della membrana plasmatica. Oltre alle rotture meccaniche sulla membrana plasmatica, una forma frequente di danno cellulare è permeabilizzazione da tossine formanti pori prodotte da batteri o cellule immunitarie ^{12,13 14,15.} Diversamente lacrime meccanici, proteine ​​formanti pori si inseriscono sulla membrana plasmatica formando una stabile, poro proteina-allineato che non può essere richiuso semplicemente applicando una "patch" membrana o da riduzioneing tensione della membrana. Curiosamente, studi hanno rivelato che le cellule di mammifero hanno un meccanismo efficace per riparare la membrana plasmatica dopo permeabilizzazione con proteine ​​formanti pori, e questo processo richiede anche la presenza di Ca ^{2 +} extracellulare ^12. Questa scoperta ha sollevato la questione se la rimozione dei pori transmembrana dalla superficie cellulare era anche un processo rapido, come osservato con ferite meccaniche ^5. Sorprendentemente, i nostri studi recenti rivelato che la richiusura delle cellule permeabilizzate con tossine formanti pori ha proprietà molto simili alla riparazione di ferite meccaniche: il processo richiede Ca ^{2 +} extracellulare, e completata entro ~ 30 sec. Indagare questo processo più in dettaglio, abbiamo recentemente appreso che, oltre a Ca ^{2 +} esocitosi regolata dei lisosomi, riparazione membrana plasmatica comporta una rapida forma di endocitosi, che viene attivato dal rilascio dell'enzima lisosomiale sfingomielinasi acida (ASM) ed è essenziale non solo per the rimozione dei pori transmembrana, ma anche per la riparazione di ferite meccaniche ^16.

Per determinare la cinetica di una nuova chiusura cellule dopo permeabilizzazione con le proteine ​​formanti pori, nel nostro laboratorio abbiamo adattato una metodologia di imaging dal vivo che era stato precedentemente utilizzato per valutare la richiusura delle fibre muscolari isolate infortunato laser ^17. Questo test si basa sulle proprietà del colorante lipofilo FM1-43, che si intercala stabilmente nel foglietto esterno di bistrati lipidici crescente di intensità di fluorescenza. Quando la membrana a doppio strato plasma viene perturbato extracellulari guadagni tinture accesso alle membrane intracellulari, fornendo un saggio sensibile per rilevare lesioni membrana plasmatica e riparare ^18,16,19,20. Per adattare questo test per la valutazione della richiusura cellule dopo permeabilizzazione con le proteine ​​formanti pori, abbiamo le cellule pre-incubate a 4 ° C con la tossina batterica streptolisina O (SLO), che si lega al colesterolo di membrana ^21. Cell sincronopermeabilizzazione può quindi essere facilmente ottenuto spostando le celle da ghiaccio per riscaldare medie in una fase microscopio riscaldata, che attiva l'oligomerizzazione e cambio di conformazione che porta alla formazione di pori transmembrana. Un vantaggio di questo approccio, nei saggi precedentemente pubblicati utilizzando ferimento laser, è che un numero maggiore di cellule possono essere analizzati simultaneamente in un campo microscopico, fornendo una migliore campionamento della popolazione cellulare. Date le similarità meccanicistiche tra il processo richiusura cellulare visto dopo l'infortunio meccanica e permeabilizzazione con le tossine che formano pori, il saggio che descriviamo qui fornisce un metodo molto versatile e potente per i fattori coinvolti nel fondamentale processo di riparazione della membrana plasmatica dissezione. Come esempio, si dimostra che è possibile utilizzare questo test per identificare fasi Ca ^{2 +} dipendenti ed indipendenti del processo di riparazione.

Protocol

1. Trascrizionale silenziamento di ASM Seme 1,5 x 10 5 cellule HeLa in 2 ml di DMEM mezzi di crescita (alto glucosio DMEM con 10% siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-glutammina, 1% Penn-Strep) su piastre inferiori 35 millimetri di vetro (MatTek) e incubare una notte a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%. Il giorno seguente, aspirato fuori i terreni di crescita e sostituirlo con 2 ml di DMEM ridotta mezzo siero (DMEM con 4% FBS), almeno 1 ora prima di aggiungere la miscela di trasfez…

Representative Results

Basse concentrazioni di batteri plasma sphingomyelinase (SM) salvataggio riparazione della membrana delle cellule impoverito in acido lisosomiale sphingomyelinase. Usando il test di imaging FM1-43, abbiamo precedentemente dimostrato che cellule carenti per la ASM lisosomiale ed esposte a SLO ferendo in presenza di Ca 2 + hanno una membrana plasmatica difetto viene salvato da extracellulare aggiunta dell'enzima umano ricombinante 19. Poiché la ASM lisosomiale umano ha …

Discussion

Studi precedenti sul pregiudizio e la membrana plasmatica riparazione meccanica invocati diversi meccanismi delle cellule feriti, che vanno dalla caduta perle di vetro, micropipetting, tranciatura, graffiare o raschiare. La lettura di tutti questi saggi era più qualitativa che quantitativa, e non dare informazioni precise sulla cinetica del meccanismo di riparazione. La capacità delle cellule di richiudere loro membrana plasmatica dopo queste forme di lesioni è stata misurata dalla presenza o assenza di rivelatori ag…

Materials

			Reagent
HeLa 229 cell line	ATCC	CCL2-1
DMEM High Glucose	Invitrogen	11965
DMEM High Glucose No Calcium	Invitrogen	20168
FM1-43	Invitrogen	T3163
Optimem Reduced Serum	Invitrogen	31985
Lipofectamine RNAiMax	Invitrogen	13778
Control medium GC content RNAi oligo	Invitrogen	12935300
SMPD1 RNAi oligo	Invitrogen	HSS143988
Fetal Bovine Serum Heat-inactivated	Gemini-Bioproducts	100-106
Sphingomyelinase from Bacillus cereus	Sigma	S7651
35 mm-glass bottom dishes	MatTek	P35G-0-14
			Material
Inverted microscope	Nikon	Eclipse Ti
Camera	Hamamatsu Photonics	C9100-50
Spinning disk confocal microscope	PerkinElmer	UltraViewVoX
Software analysis software	PerkinElmer	Volocity Suite
Environmental chamber	Pathology Devices	LiveCell System Chamber