Измерение экономического роста и динамика экспрессии генов опухолей, ориентированные<em> С. Typhimurium</em> Бактерии
Summary
Цель этих экспериментов является получение количественных временных данных курса на рост и динамику экспрессии гена ослабленного<em> С. Typhimurium</em> Бактериальных колоний, выросших внутри опухолей. Это видео покрывает опухоли клеточный препарат и имплантацию, бактерии подготовки и инъекции, всего животного люминесценции изображений, удаления опухоли и бактериальных подсчетом колонии.
Abstract
Цель этих экспериментов является получение количественных временных данных курса на рост и динамику экспрессии генов ослабленных С. Typhimurium бактериальных колоний, выросших внутри опухолей.
Мы создали модель ксенотрансплантатом опухолей у мышей путем подкожной инъекции линии человеческих клеток рака яичников, OVCAR-8 (NCI УСПД Опухоль репозиторий, Фредерик, MD).
Мы превратили ослабленные штаммы S. Typhimurium бактерий (ELH430: SL1344 phoPQ-1) с конститутивной выразил люциферазы (luxCDABE) плазмиды для визуализации 2. Эти штаммы специально колонизировать опухолей, оставаясь по существу невирулентного к мыши 1.
После измеримых опухолей были созданы, бактерии вводили внутривенно через хвостовую вену с различной дозировкой. Опухоль локализованный, бактериальной экспрессии гена контролировать в реальном времени в течение 60 часов с использованиемВ естественных изображений системы (IVIS). В каждый момент времени, опухоли вырезали, гомогенизировали и высевают на чашки с количественной бактериальных колоний для корреляции с данными экспрессии генов.
Вместе эти данные дает количественную меру в естественных условиях роста и динамика экспрессии генов бактерий, растущих внутри опухолей.
Introduction
Синтетическая биология шло быстрыми темпами в течение последнего десятилетия и в настоящее время намеревается повлиять важных проблем в энергии и здоровья. Тем не менее, экспансия в клинической практике была замедлена проблемы безопасности и отсутствие разработки проектно критериев в естественных генетических схем. Высокочастотное ускоряющее воздействие медицинских приложений потребует использования методов, которые взаимодействуют напрямую с медицинской инфраструктуры, генетических схем, которые функционируют за пределами контролируемых условиях лаборатории, и безопасным и клинически принято микробными хозяевами.
Число штаммов были исследованы для лечения рака из-за их способности расти преимущественно в опухолях. К их числу относятся C. Новый, кишечная палочка, В. cholorae, Б. лонгум и С. Typhimurium 3-8. С. Typhimurium вызвал особый интерес, поскольку они выставлены безопасности и толерантности в ряде клинических испытаний на человеке 9-12. Эти bacteri первоначально показали создать противоопухолевый эффект посредством стимуляции иммунной системы хозяина и истощением питательных веществ, необходимых для рака клеточного метаболизма. Производство лечебно груза была добавлена позднее с помощью генной модификации. Хотя эти исследования представляют важные достижения в использовании бактерий для лечения опухолей, большинство существующих усилий полагались на высоком уровне выражения, которое обычно приводит к поставке высоких дозах, и от ворот эффекты и развитие устойчивости хозяина 13-16 .
Теперь, синтетическая биология может добавить производство программируемых грузов за счет использования вычислительных разработанные генетические схемы, которые могут выполнять расширенный зондирования и доставки 17-20. Эти схемы могут быть разработаны, чтобы действовать в качестве системы доставки, которые воспринимают опухоли специфические стимулы и саморегулирование груз производства по мере необходимости. Тем не менее, изучение функций этих схем в естественных условиях до сих пор было сложно.
ve_content "> Поскольку плазмиды общей основы для синтетических схем, мы опишем метод для характеристики динамики на основе плазмиды экспрессии генов в естественных условиях использования модели мыши. Эти методы используют покадровой визуализации люминесценции и количественного измерения биораспределении. Вместе эти подходы обеспечивают основу для изучения на основе плазмиды сетей в естественных условиях для клинического применения.Protocol
Representative Results
Discussion
Используя эту процедуру, мы способны генерировать время курсов для роста и динамики экспрессии генов бактерий колонизации опухолей. В то время как эти измерения выполняются в плановом порядке в пробирке в периодической культуре или микрофлюидики устройств, они гораздо труднее в?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Х. Флеминг критического чтения и редактирования рукописи. Эта работа была поддержана Misrock Докторантура стипендий (TD) и NDSEG стипендий (AP). ШНБ следователь HHMI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| 3/10 cc Insulin Syringe | BD Biosciences | 309301 | |
| PrecisionGlide Needle | BD Biosciences | 301629 | |
| RPMI Medium 1640 (1X), liquid, with L-glutamine | Invitrogen | 11875-119 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | |
| LB Agar Broth | Sigma Aldrich | L2897 | |
| Luria-Bertani broth | BD Biosciences | 244610 |
References
- Hohmann, E. L., Oletta, C. A., Miller, S. I. Evaluation of a phoP/phoQ-deleted, aroA-deleted live oral Salmonella typhi vaccine strain in human volunteers. Vaccine. 14 (1), 19-24 (1996).
- Leschner, S., et al. Tumor Invasion of Salmonella enterica Serovar Typhimurium Is Accompanied by Strong Hemorrhage Promoted by TNF-alpha. Plos One. 4 (8), (2009).
- Min, J. J., et al. Quantitative bioluminescence imaging of tumor-targeting bacteria in living animals. Nat. Protoc. 3 (4), 629-636 (2008).
- Min, J. J., et al. Noninvasive real-time imaging of tumors and metastases using tumor-targeting light-emitting Escherichia coli. Mol. Imaging Biol. 10 (1), 54-61 (2008).
- Choy, G., et al. Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging. Biotechniques. 35 (5), 1022-1033 (2003).
- Pawelek, J. M., Low, K. B., Bermudes, D. Tumor-targeted Salmonella as a novel anticancer vector. Cancer Research. 57 (20), 4537-4544 (1997).
- Fu, X., Hoffman, R. M. Human ovarian carcinoma metastatic models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically-intact patient specimens. Anticancer Res. 13 (2), 283-286 (1993).
- Ozbudak, E. M., et al. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nat. Genet. 31 (1), 69-73 (2002).
- Elowitz, M. B., et al. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).
- Toso, J. F., et al. Phase I study of the intravenous administration of attenuated Salmonella typhimurium to patients with metastatic melanoma. J. Clin. Oncol. 20 (1), 142-152 (2002).
- Heimann, D. M., Rosenberg, S. A. Continuous intravenous administration of live genetically modified salmonella typhimurium in patients with metastatic melanoma. J. Immunother. 26 (2), 179-180 (2003).
- Forbes, N. S. Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 10 (11), 785-794 (2010).
- Guo, H., et al. Targeting tumor gene by shRNA-expressing Salmonella-mediated RNAi. Gene Ther. 18 (1), 95-105 (2011).
- Hoffman, R. M. Tumor-seeking Salmonella amino acid auxotrophs. Curr Opin Biotechnol. 22 (6), 917-923 (2011).
- Nguyen, V. H., et al. Genetically engineered Salmonella typhimurium as an imageable therapeutic probe for cancer. Cancer Research. 70 (1), 18-23 (2010).
- Zhao, M., et al. Targeted therapy with a Salmonella typhimurium leucine-arginine auxotroph cures orthotopic human breast tumors in nude mice. Cancer Research. 66 (15), 7647-7652 (2006).
- Danino, T., et al. A synchronized quorum of genetic clocks. Nature. 463 (7279), 326-330 (2010).
- Anderson, J. C., et al. Environmentally controlled invasion of cancer cells by engineered bacteria. J. Mol. Biol. 355 (4), 619-627 (2006).
- Hasty, J., McMillen, D., Collins, J. J. Engineered gene circuits. Nature. 420 (6912), 224-230 (2002).
- Prindle, A., et al. A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’. Nature. 481 (7379), 39-44 (2012).
- Xu, D. Q., et al. Bacterial delivery of siRNAs: a new approach to solid tumor therapy. Methods Mol. Biol. 487, 161-187 (2009).
- Zheng, L. M., et al. Tumor amplified protein expression therapy: Salmonella as a tumor-selective protein delivery vector. Oncol. Res. 12 (3), 127-1235 (2000).
- Kim, K., et al. A novel balanced-lethal host-vector system based on glmS. Plos One. 8 (3), e60511 (2013).
- Prindle, A., et al. Genetic Circuits in Salmonella typhimurium. ACS Synthetic Biology. , (2012).
- Danino, T., et al. In vivo gene expression dynamics of tumor-targeted bacteria. ACS Synthetic Biology. , (2012).
- Zhao, M., et al. Spatial-temporal imaging of bacterial infection and antibiotic response in intact animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17), 9814-9818 (2001).
