Summary

Tümör Hedefli ölçülmesi Büyüme ve Gen İfade Dynamics<em> S. Typhimurium</em> Bakteri

Published: July 06, 2013
doi:

Summary

Bu deneylerin amacı, zayıflatılmış büyümesi ve gen ekspresyonu dinamikleri üzerinde niceliksel zamana bağlı verilerini oluşturmak için bir<em> S. typhimurium</emTümörleri içinde büyüyen> bakteri kolonileri. Bu video tümör hücre hazırlama ve implantasyonu, bakteri hazırlanması ve enjeksiyon, tam hayvan lüminesans görüntüleme, tümör eksizyonu ve bakteri kolonisi sayma kapsar.

Abstract

Bu deneylerin amacı, hafifletilmiş S. büyümesi ve gen ekspresyonu dinamikleri üzerinde niceliksel zamana bağlı verilerini oluşturmak için bir tümörleri içinde büyüyen typhimurium bakteri kolonileri.

Bir insan yumurtalık kanseri hücre hattı deri altına enjeksiyon, OVCAR-8 (NCI DCTD Tümör Deposu'ndan, Frederick, MD). Farelerde modeli ksenograft tümörler oluşturulan

Biz, S. zayıflatılmış suş transforme görselleştirme 2 plazmid yapıcı şekilde tanımlanmış lusiferaz (luxCDABE) ile: typhimurium bakteriler (SL1344 phoPQ-1 ELH430). Fare 1, esas olarak non-virulent kalarak Bu suşlar, özellikle tümörler kolonize olur.

Ölçülebilir tümörler tesis edildiğinde, bakteri dozaj değişen kuyruk damarı yoluyla venöz içinden enjekte edildi. Tümör-lokalize, bakteri gen ekspresyonundaki kullanarak 60 saatlik bir süre boyunca gerçek zamanlı olarak izlenmiştirin vivo görüntüleme sistemi (IVIS) içinde. Her zaman noktasında, tümörler homojenize eksize ve gen ekspresyon verileri ile korelasyon için bakteri kolonileri ölçmek için kaplandı.

Birlikte, bu veriler tümörler içinde büyüyen bakterilerin in vivo büyüme ve gen dinamikleri içinde bir nicel ölçü verir.

Introduction

Sentetik biyoloji son on yılda hızla ilerlemiştir ve şimdi enerji ve sağlık önemli sorunları etkisi konumlandırılmış. Ancak, klinik alana genişleme güvenlik endişeleri ve in vivo genetik devrelerinde için tasarım kriterleri geliştirme bir yokluğu ile yavaşladı edilmiştir. Yüksek darbe tıbbi uygulamaları hızlandırılması tıbbi altyapı, kontrollü laboratuar ortamı dışında işlev genetik devreleri, ve güvenli ve klinik-kabul mikrobiyal bilgisayarlar ile doğrudan arabirim yöntemleri kullanarak gerektirecektir.

Suş tümörlerde tercihen büyümeye yeteneklerine bağlı olarak kanser tedavisi için incelenmiştir. Bu C eklemiş novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum, ve S. typhimurium 3-8. S. onlar 9-12 insan klinik çalışmalarda bir dizi güvenlik ve hoşgörü sergilenen gibi typhimurium özel bir ilgi yarattı. Bu bakteri Bir ilk konak bağışıklık sisteminin uyarılması yoluyla ve kanser hücre metabolizması için gerekli besinlerin tükenmesi ile bir anti-tümör etkileri oluşturmak için gösterilmiştir. Tedavi kargo üretimi daha sonra genetik değişiklikler ile eklendi. Bu çalışmalar tümör tedavileri için bakteri kullanımı önemli ilerlemeler temsil ederken, mevcut çabalar çoğunluğu genellikle çok yüksek dozlarda, hedef dışı etkiler ve ana 13-16 direnç gelişimi teslimat ile sonuçlanan yüksek düzeyde ekspresyon yararlanmıştır .

Şimdi, sentetik biyoloji gelişmiş algılama ve dağıtım 17-20 gerçekleştirebilirsiniz hesaplama tasarlanmış genetik devreleri kullanarak programlanabilir yük üretim ekleyebilirsiniz. Bu devreler, tümör spesifik uyaran ve gerektiğinde kendi kendini düzenleyen kargo üretim anlamda dağıtım sistemleri olarak hareket için dizayn edilebilir. Ancak, in vivo olarak, bu devrelerin fonksiyonu çalışmalarında şimdiye kadar zor olmuştur.

plazmid sentetik devreleri için ortak bir çerçeve olan ve_content "> bu yana, bir fare modeli kullanılarak in vivo plazmid tabanlı gen ifadesinin dinamiklerini karakterize etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntemler zaman atlamalı lüminesans görüntüleme ve biodistribution kantitatif ölçümü kullanmaktadır. birlikte, Bu yaklaşımların klinik uygulamalar için in vivo plazmid tabanlı ağlar eğitim için bir çerçeve sağlar.

Protocol

1. Hücre Hazırlanması Standart hücre kültürü teknikleri kullanılarak geçişi hücre çizgileri dahildir. Bu deneyde, OVCAR-8 hücreleri (NCI DCTD Tümör Deposu, Frederick, MD) kullanılır. 100% – 80 confluency bir hedef hücreleri büyütün. 5 dakika boyunca 5 ml tripsin ile inkübe hücreleri, ardından + FBS tripsin inaktive 5 ml RPMI ortamı ilave edin. Hemasitometre üzerinde hasat ve sayısı hücreleri. 5 x 10 7 hücre / ml ya da şişesi başına yaklaşık 20…

Representative Results

Bu protokol kullanarak, tümör hedef bakteri in vivo büyüme ve gen dinamikleri veri elde edebiliyoruz. Genel akışı Şekil 1 'de özetlenmiştir. İlk aşamada, biz lüminesans (mavi) bir muhabir olarak ile gen ekspresyon ölçmek için IVIS kullanarak hayvan bakteri enjekte (yeşil) ve görüntü. Daha sonra, ikinci aşamada, biz tüketim, homojenize ve koloni sayımı için plaka tümörler tümör büyüyen bakteri s…

Discussion

Bu prosedür kullanılarak, böylece tümörü kolonize bakteri büyümesi ve gen ekspresyonu dinamikleri için zaman içerisinde elde edebiliyoruz. Bu ölçümler rutin parti kültür ya da mikroflüidik cihazlar, in vitro olarak gerçekleştirilir olsa da, in vivo olarak gerçekleştirmek için çok daha zordur.

Bu yöntemler uygulanabilir çeşitli değişiklikler vardır. Bizim fare modelleri oluşturmak için OVCAR-8 hücre kullanılır iken, diğer hücre hatları, bi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz yazının eleştirel okuma ve düzenleme için H. Fleming teşekkür ederim. Bu çalışma Misrock Doktora Sonrası Bursu (TD) ve NDSEG yüksek lisans bursu (AP) tarafından desteklenmiştir. SNB bir HHMI Araştırmacı olduğunu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml syringe BD Biosciences 309602
3/10 cc Insulin Syringe BD Biosciences 309301
PrecisionGlide Needle BD Biosciences 301629
RPMI Medium 1640 (1X), liquid, with L-glutamine Invitrogen 11875-119
Ampicillin Sigma Aldrich A0166-5G
LB Agar Broth Sigma Aldrich L2897
Luria-Bertani broth BD Biosciences 244610

References

  1. Hohmann, E. L., Oletta, C. A., Miller, S. I. Evaluation of a phoP/phoQ-deleted, aroA-deleted live oral Salmonella typhi vaccine strain in human volunteers. Vaccine. 14 (1), 19-24 (1996).
  2. Leschner, S., et al. Tumor Invasion of Salmonella enterica Serovar Typhimurium Is Accompanied by Strong Hemorrhage Promoted by TNF-alpha. Plos One. 4 (8), (2009).
  3. Min, J. J., et al. Quantitative bioluminescence imaging of tumor-targeting bacteria in living animals. Nat. Protoc. 3 (4), 629-636 (2008).
  4. Min, J. J., et al. Noninvasive real-time imaging of tumors and metastases using tumor-targeting light-emitting Escherichia coli. Mol. Imaging Biol. 10 (1), 54-61 (2008).
  5. Choy, G., et al. Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging. Biotechniques. 35 (5), 1022-1033 (2003).
  6. Pawelek, J. M., Low, K. B., Bermudes, D. Tumor-targeted Salmonella as a novel anticancer vector. Cancer Research. 57 (20), 4537-4544 (1997).
  7. Fu, X., Hoffman, R. M. Human ovarian carcinoma metastatic models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically-intact patient specimens. Anticancer Res. 13 (2), 283-286 (1993).
  8. Ozbudak, E. M., et al. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nat. Genet. 31 (1), 69-73 (2002).
  9. Elowitz, M. B., et al. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).
  10. Toso, J. F., et al. Phase I study of the intravenous administration of attenuated Salmonella typhimurium to patients with metastatic melanoma. J. Clin. Oncol. 20 (1), 142-152 (2002).
  11. Heimann, D. M., Rosenberg, S. A. Continuous intravenous administration of live genetically modified salmonella typhimurium in patients with metastatic melanoma. J. Immunother. 26 (2), 179-180 (2003).
  12. Forbes, N. S. Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 10 (11), 785-794 (2010).
  13. Guo, H., et al. Targeting tumor gene by shRNA-expressing Salmonella-mediated RNAi. Gene Ther. 18 (1), 95-105 (2011).
  14. Hoffman, R. M. Tumor-seeking Salmonella amino acid auxotrophs. Curr Opin Biotechnol. 22 (6), 917-923 (2011).
  15. Nguyen, V. H., et al. Genetically engineered Salmonella typhimurium as an imageable therapeutic probe for cancer. Cancer Research. 70 (1), 18-23 (2010).
  16. Zhao, M., et al. Targeted therapy with a Salmonella typhimurium leucine-arginine auxotroph cures orthotopic human breast tumors in nude mice. Cancer Research. 66 (15), 7647-7652 (2006).
  17. Danino, T., et al. A synchronized quorum of genetic clocks. Nature. 463 (7279), 326-330 (2010).
  18. Anderson, J. C., et al. Environmentally controlled invasion of cancer cells by engineered bacteria. J. Mol. Biol. 355 (4), 619-627 (2006).
  19. Hasty, J., McMillen, D., Collins, J. J. Engineered gene circuits. Nature. 420 (6912), 224-230 (2002).
  20. Prindle, A., et al. A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’. Nature. 481 (7379), 39-44 (2012).
  21. Xu, D. Q., et al. Bacterial delivery of siRNAs: a new approach to solid tumor therapy. Methods Mol. Biol. 487, 161-187 (2009).
  22. Zheng, L. M., et al. Tumor amplified protein expression therapy: Salmonella as a tumor-selective protein delivery vector. Oncol. Res. 12 (3), 127-1235 (2000).
  23. Kim, K., et al. A novel balanced-lethal host-vector system based on glmS. Plos One. 8 (3), e60511 (2013).
  24. Prindle, A., et al. Genetic Circuits in Salmonella typhimurium. ACS Synthetic Biology. , (2012).
  25. Danino, T., et al. In vivo gene expression dynamics of tumor-targeted bacteria. ACS Synthetic Biology. , (2012).
  26. Zhao, M., et al. Spatial-temporal imaging of bacterial infection and antibiotic response in intact animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17), 9814-9818 (2001).

Play Video

Cite This Article
Danino, T., Prindle, A., Hasty, J., Bhatia, S. Measuring Growth and Gene Expression Dynamics of Tumor-Targeted S. Typhimurium Bacteria. J. Vis. Exp. (77), e50540, doi:10.3791/50540 (2013).

View Video