एंजियोजिनेसिस जांच नवजात माउस रेटिना का पूरा पर्वत immunofluorescent धुंधला<em> विवो में</em
Summary
नवजात murine रेटिना एक में angiogenesis मिलाना कि विभिन्न जीनों या दवाओं की भूमिका की जांच की अनुमति देता है angiogenesis की एक अच्छी तरह से विशेषता शारीरिक मॉडल, प्रदान करता है<em> Vivo में</em> संदर्भ. सही संवहनी जाल कल्पना करने के लिए Immunofluorescent धुंधला पढ़ाई के इन प्रकार की सफलता के लिए निर्णायक है.
Abstract
Angiogenesis एक पूर्व मौजूदा पोत नेटवर्क से नए रक्त वाहिकाओं के अंकुरण से परिभाषित नए रक्त वाहिनियों के गठन की जटिल प्रक्रिया है. Angiogenesis जैसे कैंसर, अंधापन और इस्कीमिक रोगों के रूप में रक्त वाहिनियों के गठन dysregulated है जिसमें कई बीमारियों में भी न केवल अंगों और ऊतकों के सामान्य विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, लेकिन. Angiogenesis के रोग में विशेष रूप से नई वाहिनियों के गठन के लिए प्रयास करें और विनियमित करने के लिए उपन्यास दवा के विकास के लिए एक महत्वपूर्ण लक्ष्य है ताकि वयस्क जीवन में, रक्त वाहिकाओं आम तौर पर मौन हैं. बेहतर angiogenesis को समझने के लिए और इसे विनियमित करने के लिए उचित रणनीति विकसित करने के लिए, मॉडल सही शामिल हैं जो विभिन्न जैविक कदम दर्शाते हैं कि आवश्यक हैं. धमनियों, नसों और capillaries के जन्म के बाद पहले सप्ताह के दौरान एक नाड़ी जाल के लिए फार्म विकसित क्योंकि माउस नवजात रेटिना angiogenesis का एक उत्कृष्ट मॉडल उपलब्ध कराता है. यह मॉडल भी एक दो डि होने का लाभ दिया हैmensional (2 डी) संरचना अन्य संवहनी नेटवर्क की जटिल 3 डी शारीरिक रचना के साथ तुलना में सरल विश्लेषण कर रही है. जन्म के बाद अलग अलग समय पर रेटिना संवहनी जाल का विश्लेषण करके, यह खुर्दबीन के नीचे angiogenesis के विभिन्न चरणों का पालन करने के लिए संभव है. यह लेख isolectin और नाड़ी विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ फ्लोरोसेंट धुंधला का उपयोग एक माउस रेटिना की वाहिका संरचना का विश्लेषण करने के लिए एक सरल प्रक्रिया को दर्शाता है.
Introduction
Angiogenesis एक पूर्व मौजूदा पोत नेटवर्क से नए रक्त वाहिकाओं के गठन से परिभाषित किया गया है और कई संकेत दे रास्ते के द्वारा नियंत्रित किया जाता है एक जटिल विकास की प्रक्रिया है. इनमें से सबसे प्रमुख VEGF के मार्ग है. VEGF के पड़ोसी रक्त वाहिकाओं में अंकुरण वाहिकाजनक की दीक्षा से इस्कीमिक कोशिकाओं और सुराग द्वारा जारी की है. अंकुर एक नई नाड़ी से अग्रणी endothelial सेल VEGF के स्रोत की ओर बाहर तक पहुँचने कि filopodia पैदा करता है जो एक 'टिप' सेल, है, और 'डंठल' endothelial कोशिकाओं proliferating के बाद है. इस तरह, सक्रिय endothelial कोशिकाओं विस्थापित और वे नए संवहनी ट्यूबों फार्म जहां एक avascular क्षेत्र के प्रति पैदा करना. रक्त प्रवाह का समर्थन करने के लिए इन ट्यूबों को स्थिर करने के लिए, endothelial कोशिकाओं pericytes और नए रक्त वाहिकाओं 1 चारों ओर जो चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के साथ बातचीत. Angiogenesis भ्रूण और बढ़ ऊतकों के vascularization के लिए आवश्यक है. हालांकि, यह भी कई pathologi के लिए योगदानइस तरह के कैंसर के रूप में कैलोरी विकार, angiogenesis में दोष इस्कीमिक रोगों के साथ जुड़े रहे हैं. रोग के उपचार के एक साधन के रूप में angiogenesis को विनियमित करने के लिए प्रभावी दवा उपचार के विकास के बहुत रुचि है इसलिए. उदाहरण के लिए, प्रभावी विरोधी angiogenic कारकों, कैंसर के विकास को कम समर्थक angiogenic रणनीतियों इस्कीमिक रोग के इलाज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है whilst जाएगा. इस प्रकार, angiogenesis के मॉडल बेहतर नई वाहिनियों के गठन की और संवहनी विकास को बढ़ाने या कम करने के लिए नए उपचार रणनीति विकसित करने के लिए नियमन को समझने के लिए आवश्यक हैं.
Angiogenesis अनुसंधान का एक मौलिक तत्व एक उपयुक्त संवहनी मॉडल का विकल्प है. इन विट्रो मॉडल में कई ऐसे endothelial सेल प्रवास, प्रसार और अस्तित्व 2,3 के रूप में angiogenesis की बुनियादी कदम पुन: पेश करने के लिए डिजाइन किया गया है. अक्सर इन विट्रो परख में इस्तेमाल किया, हालांकि टी, एक Matrigel मैट्रिक्स पर endothelial कोशिकाओं की एक branched नेटवर्क के गठन हैउसकी endothelial कोशिकाओं के लिए विशिष्ट नहीं है, न ही यह आमतौर पर pericytes या चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के समर्थन को शामिल करता है. ऐसे embryoid शरीर परख, महाधमनी रिंग परख और भ्रूण प्रपदिकीय परख के रूप में माउस अंग संस्कृति का उपयोग कर पूर्व vivo अंकुरण angiogenesis के आकलन अतिरिक्त समर्थन कोशिकाओं के संदर्भ में endothelial कोशिकाओं की angiogenesis के विश्लेषण की अनुमति देता है. हालांकि, इन assays के मुख्य सीमाओं के विश्लेषण के लिए एक सीमित खिड़की दे रही है, रक्त प्रवाह की कमी और समय पर जहाजों की प्रतिगमन शामिल हैं. इसलिए, अधिक सही angiogenesis के विनियमन को समझने के लिए, vivo मॉडल में के रूप में अच्छी तरह से पिछले अंग ischemia के मॉडल के रूप में, इस तरह के subcutaneously प्रत्यारोपित स्पंज या Matrigel प्लग का उपयोग कर माउस में विकसित उन के रूप में आवश्यक हैं. हालांकि, इन मॉडलों neovessels की जटिल 3 डी वास्तुकला के कारण का विश्लेषण करने की चुनौती दे रहे हैं. इसके विपरीत, zebrafish भ्रूण पूरे visualizing angiogenesis के लिए एक शानदार मॉडल साबित कर दिया हैजीव 4. हालांकि, माउस माउस कई मामलों में एक पसंदीदा मॉडल बनाने, evolutionarily को और अधिक बारीकी से zebrafish से मानव से संबंधित है. नतीजतन प्रसव के बाद माउस रेटिना के angiogenesis को angiogenesis अनुसंधान के लिए पसंद की एक अच्छी तरह से विशेषता विधि का प्रतिनिधित्व करता है. यह एक मनोवैज्ञानिक की स्थापना, लेकिन यह भी आसानी से उपयुक्त फ्लोरोसेंट दाग का उपयोग कल्पना की जा सकती है कि एक 2 डी संवहनी जाल प्रदान करता है न केवल. पोत नेटवर्क, endothelial प्रसार, अंकुरण, परिवाहकीय सेल भर्ती और पोत remodeling के वास्तुकला सब इस तकनीक का उपयोग कर जांच की जा सकती है.
नवजात माउस रेटिना में, रेटिना की रक्त वाहिकाओं के विकास को प्रसव के बाद जीवन के पहले सप्ताह में होता है. चूहे, मनुष्यों के विपरीत, अंधा पैदा होते हैं और retinas के जन्म के बाद ही vascularized हो जाते हैं. रेटिना वाहिकाओं प्रसव के बाद दिन 0 (P0) में ऑप्टिक तंत्रिका रेटिना करीब के केंद्र से उत्पन्न होती हैं, और एक अत्यधिक व्यवस्थित करने के लिए फार्म angiogenesis के द्वारा विकसितलगभग P8 5 से रेटिना की परिधि तक पहुँच जाता है कि घ संवहनी जाल. रक्त वाहिकाओं केशिका जाल धीरे – धीरे एक बीच केशिका नेटवर्क के साथ धमनियों और नसों की एक नियमित रूप से बारी पैटर्न उत्पन्न करने के लिए परिधि की ओर ऑप्टिक डिस्क से बाहर की ओर बढ़ के साथ एक विशेषता तरीके से विकसित करना. रेटिना वाहिका संरचना इस प्रकार यह अपेक्षाकृत आसान फ्लैट माउंट तैयारी 5 में रेटिना वाहिका संरचना की जांच के लिए बना रही है, वे अनिवार्य रूप से एक 2 डी विमान है क्या में बढ़ने के रूप में जहाजों को आसानी से पहचाना जा सकता है के रूप में angiogenesis को अध्ययन करने के लिए एक आदर्श मॉडल उपलब्ध कराता है. कई घंटे पूर्व vivo अधिक एन्दोथेलिअल टिप सेल प्रतिक्रियाओं के विश्लेषण के लिए माउस नवजात रेटिना अलग करने के लिए एक विधि 6 सूचित किया गया है. वैकल्पिक रूप से, पूरे रेटिना वाहिका संरचना और संबद्ध संवहनी मार्कर के एक अधिक विस्तृत जांच के विकास के विभिन्न चरणों में तय रेटिना नमूनों की immunostaining की आवश्यकता है.
यहाँ हम प्रदान करते हैंहम खुर्दबीन के नीचे अंतिम इमेजिंग को धुंधला प्रोटोकॉल के माध्यम से (भी 7 देखें) प्रसव के बाद आंख की प्रारंभिक स्पष्टीकरण से murine रेटिना संवहनी जाल, के पूरे माउंट धुंधला के लिए उपयोग करें कि एक विश्वसनीय और तकनीकी रूप से सीधे आगे विधि का विस्तृत वर्णन.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ प्रस्तुत विधि यह angiogenesis के एक आसानी से व्यावहारिक और physiologically प्रासंगिक मॉडल बनाने, नवजात माउस retinas का दाग पूरी माउंट तैयारी की छवियों को प्राप्त करने के लिए एक सरल और कारगर तरीका प्रदान करता है. प्रारंभ …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम वेलकम ट्रस्ट और ब्रिटिश हार्ट फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Materials
| Material | |||
| Plastic pipettes 3 ml | Scientific Laboratory Supplies | PIP4210 | Remove tip with scissors to create a wide bore |
| BD Falcon 24-well plates | Scientific Laboratory Supplies | 353226 | |
| Select Petri dishes TV 90 mm | Scientific Laboratory Supplies | SLS2002 | |
| Histobond slides | VWR | 631-0624 | |
| Coverslips 22 x 22 mm | VWR | 631-1336 | |
| Dumont Tweezers #5 | World precision instruments | 14095 | |
| Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades | World precision instruments | 501235 | Used for enucleation |
| Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips | World precision instruments | 500086 | Used for dissecting retina |
| Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips | World precision instruments | 501778 | Used for dissecting retina |
| crystal clear’ tubes 2 ml | Starlab | E1420-2000 | |
| Reagents | |||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876 | PBS reagent |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | PBS reagent |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | PBS reagent |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Make up in 2x PBS and store at -20 °C |
| BSA | Sigma | A7638 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Donkey serum | Sigma | D9663 | |
| Goat serum | Vector | S-1000 | |
| Prolong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36930 | Mounting reagent |
| Isolectin GS-IB4-alexa 594 | Invitrogen | I21413 | Use at 1:200 dilution |
| Isolectin GS-IB4-alexa 488 | Invitrogen | I21411 | Use at 1:200 dilution |
| Primary Antibodies | |||
| Anti-NG2 (rabbit polyclonal ) | Millipore | AB5320 | Detects pericytes |
| Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal) | Millipore | MAB360 | Detects astrocytes |
| Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal) | Millipore | 04-585 | Detects pericytes |
| Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal ) | Chemicon | AB756P | Detects vascular basement membrane |
| Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal) | Sigma | C6198 | Detects vascular smooth muscle cells. |
| Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal) | BD Pharmingen | 550546 | Detects endothelial cells |
| Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal) | BD Pharmingen | 553370 | Detects endothelial cells |
| Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal) | BD Pharmingen | 550548 | Detects endothelial cell junctions |
| Anti-Alk1 (goat polyclonal) | R&D Systems | AF770 | Detects endothelial cells |
| Secondary Antibodies | |||
| Goat anti-rabbit-Alexa594 | Invitrogen | A11012 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Goat anti-rat-Alexa488 | Invitrogen | A11006 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Goat anti-rat-Alexa594 | Invitrogen | A11007 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Goat anti-mouse-Alexa488 | Invitrogen | A11029 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Donkey anti-goat-Alexa594 | Invitrogen | A11058 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
| Microscopes | |||
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Camera | Zeiss | Axiocam HRc | Camera for dissection microscope |
| Epifluorescent Microscope | Zeiss | Axioimager with Apotome | |
| Camera | Zeiss | Axiocam HRm | Camera for Axioimager |
| Confocal Microscope | Nikon | A1R |
References
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).
- Staton, C. A., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int J. Exp. Pathol. 85 (5), 233-248 (2004).
- Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74 (2-3), 172-183 (2007).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev. Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
- Fruttiger, M. Development of the retinal vasculature. Angiogenesis. 10 (2), 77-88 (2007).
- Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses. Nat. Protoc. 5 (10), 1659-1665 (1038).
- Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. Mouse eye enucleation for remote high-throughput phenotyping. J. Vis. Exp. (57), e3184 (2011).
- Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nat. Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).
- Allinson, K. R., Lee, H. S., Fruttiger, M., McCarty, J., Arthur, H. M. Endothelial expression of TGFbeta type II receptor is required to maintain vascular integrity during postnatal development of the central nervous system. PLoS One. 7 (9), e39336 (2012).
- Mahmoud, M., et al. Pathogenesis of arteriovenous malformations in the absence of endoglin. Circ. Res. 106 (8), 1425-1433 (2010).
- Lebrin, F., et al. Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia. Nat. Med. 16 (4), 420-428 (2010).
- Pi, L., et al. Role of connective tissue growth factor in the retinal vasculature during development and ischemia. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 52 (12), 8701-8710 (2011).
- Powner, M. B., et al. Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nat. Protoc. 7 (6), 1086-1096 (2012).
