Whole Mount coloração de imunofluorescência do Rato Retina Neonatal para investigar angiogênese<em> In vivo</em

Summary

A retina de murino neonatal fornece um modelo fisiológico bem caracterizado da angiogénese, que permite investigações dos papéis dos diferentes genes ou drogas que modulam a angiogénese em<em> In vivo</em> Contexto. Coloração por imunofluorescência de visualizar com precisão o plexo vascular é essencial para o sucesso destes tipos de estudos.

Abstract

A angiogénese é o processo complexo da nova formação de vasos sanguíneos definido pelo surgimento de novos vasos sanguíneos a partir de uma rede de vasos pré-existentes. A angiogénese desempenha um papel importante não só no desenvolvimento normal dos órgãos e tecidos, mas também de muitas doenças em que a formação de vasos sanguíneos é desregulada, tal como o cancro, cegueira e doenças isquémicas. Na vida adulta, os vasos sanguíneos são geralmente de repouso para a angiogênese é um alvo importante para a novela desenvolvimento de drogas para tentar regular a formação de novos vasos especificamente na doença. A fim de entender melhor a angiogênese e desenvolver estratégias adequadas para regulamentá-la, os modelos são necessários que refletem com precisão as diferentes etapas biológicos que estão envolvidos. A retina do rato neonatal fornece um excelente modelo da angiogénese porque as artérias, veias e capilares desenvolver para formar um plexo vascular durante a primeira semana após o nascimento. Este modelo também tem a vantagem de ter um dois-disional estrutura (2D) fazendo análise directa em comparação com o complexo anatomia 3D de outras redes vasculares. Ao analisar o plexo vascular retiniano em diferentes momentos após o nascimento, é possível observar os diferentes estádios da angiogénese sob o microscópio. Este artigo demonstra um procedimento simples para analisar a vascularização da retina de um rato utilizando a coloração fluorescente com anticorpos específicos isolectin e vascular.

Introduction

A angiogénese é um processo de desenvolvimento complexo definida pela formação de novos vasos sanguíneos a partir de uma rede de vasos pré-existentes e é regulada por vários caminhos de sinalização. A mais importante destas é a via de VEGF. VEGF é liberado por células isquêmicos e leva à abertura de angiogênico brotando nos vasos sanguíneos vizinhos. A principal célula endotelial vascular a partir de um novo rebento é uma célula "ponta", que produz filopodios que chegar em direcção à fonte de VEGF, e é seguida por proliferação de células endoteliais "stalk". Desta forma, as células endoteliais activadas migrar e proliferar no sentido de uma região avascular, onde formam novos tubos vasculares. A fim de estabilizar esses tubos para apoiar o fluxo sanguíneo, as células endoteliais, pericitos e interagir com as células musculares lisas, que rodeiam os vasos sanguíneos novos ^1. A angiogénese é essencial para a vascularização do embrião e os tecidos em crescimento. No entanto, também contribui para muitos patológicasdistúrbios cal, tais como câncer, enquanto os defeitos na angiogênese estão associados com doenças isquêmicas. O desenvolvimento de tratamentos eficazes para regular a angiogénese de drogas como um meio para o tratamento da doença é, portanto, de grande interesse. Por exemplo, os factores anti-angiogénicos eficaz irá reduzir o crescimento do cancro, enquanto pró-angiogénicos estratégias podem ser usadas para tratar a doença isquémica. Assim, os modelos de angiogénese é essencial para compreender melhor a regulação da formação de novos vasos e para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para aumentar ou diminuir o crescimento vascular.

Um elemento fundamental da pesquisa angiogénese é a escolha de um modelo adequado vascular. Muitos modelos in vitro ter sido concebido para reproduzir os passos básicos da angiogénese, tais como migração de células endoteliais, proliferação e sobrevivência ^2,3. Um frequentemente utilizado no ensaio in vitro é a formação de uma rede ramificada de células endoteliais sobre uma matriz Matrigel, apesar de tele não é específico para células endoteliais, nem geralmente incorporam o apoio de pericitos ou de células musculares lisas. Avaliação ex vivo da angiogénese brotando do rato usando a cultura de órgãos, tais como o ensaio de corpo embrióides, o ensaio do anel aórtico e o ensaio metatarso fetal permite a análise da angiogénese de células endoteliais, no contexto de células de suporte adicionais. No entanto, as principais limitações destes ensaios incluem a falta de fluxo sanguíneo e a regressão dos vasos ao longo do tempo, dando uma janela limitada para análise. Portanto, para compreender a regulação da angiogénese, mais precisamente, em modelos in vivo são necessários, tais como os desenvolvidos em ratinhos usando esponjas implantadas subcutaneamente ou tampões matrigel, bem como o modelo de isquemia dos membros posteriores. No entanto, estes modelos são difíceis de analisar devido ao complexo de arquitectura em 3D do neovasos. Em contraste, o embrião do peixe-zebra demonstrou ser um excelente modelo para a visualização de angiogénese no conjunto⁴ organismo. No entanto, o rato é evolutivamente muito mais intimamente relacionada com a humana do peixe-zebra, tornando o rato um modelo preferido, em muitos casos. Consequentemente angiogénese da retina do rato pós-natal, representa um método bem caracterizado de escolha para a pesquisa da angiogênese. Ele não só proporciona um ambiente fisiológico, mas também um plexo vascular 2D que podem ser facilmente visualizada utilizando manchas fluorescentes adequadas. A arquitetura da rede de vasos, proliferação endotelial, surgimento, o recrutamento de células perivascular e remodelamento podem ser investigadas usando esta técnica.

Na retina de rato neonatal, o desenvolvimento dos vasos sanguíneos da retina ocorre na primeira semana de vida pós-natal. Ratos, ao contrário dos humanos, nascem cegos e as retinas só se tornam vascularizado após o nascimento. Vasos retinianos surgir a partir do centro da retina perto do nervo óptico no dia 0 pós-natal (P0), e por angiogénese desenvolver para formar um altamente organizard plexo vascular que atinge a periferia da retina de cerca de ⁵ P8. Os vasos sanguíneos em desenvolvimento de uma forma característica, com o plexo capilar progressivamente crescente para fora a partir do disco óptico para a periferia para gerar um padrão de alternância regular das artérias e veias, com uma rede capilar interveniente. A vasculatura retiniana fornece um modelo ideal para estudar angiogénese, porque os vasos pode ser facilmente identificado à medida que crescem no que é essencialmente um plano 2D, tornando-se assim relativamente fácil para examinar a vasculatura da retina em preparações plana de montagem ^5. Um método para isolar a retina do rato neonatal para análise de respostas de células endoteliais da ponta ao longo de várias horas ex vivo, foi avaliado ^6. Alternativamente, uma investigação mais detalhada de todo o sistema vascular da retina e marcadores vasculares associadas requer imunocoloração de amostras retina fixos em diferentes fases de desenvolvimento.

Aqui nós fornecemosUma descrição detalhada de um método confiável e tecnicamente simples que usamos para a coloração de montagem todo o plexo vascular retiniana de murino, a partir da enucleação inicial de pós-natal do olho (ver também a ⁷⁾ por meio dos protocolos de coloração para imagiologia último sob o microscópio.

Protocol

Todos os passos são realizados à temperatura ambiente, salvo indicação em contrário. 1. Enucleação e Fixação de pós-parto Olhos Posicione o mouse sacrificados filhote de cachorro de lado, retire a pele que cobre o olho com uma tesoura. Use uma tesoura e uma pinça para enuclear o olho. Coloque tesoura abaixo do olho enucleado, cortar o nervo óptico e os tecidos circundantes e retire o olho. Transfira para uma placa de 24 poços contendo 4% de parafor…

Representative Results

Após a dissecção da retina deve ser semelhante a uma flor plana (Figura 1). Usando o protocolo descrito acima, as células endoteliais podem ser vistas por meio da coloração B4-Alexa488 isolectin e apoiando células musculares vasculares são visualizadas através de actina do músculo liso anti-alfa (Figura 2). O ponto de vista de baixa potência usando uma objetiva de 5X na Figura 2 permite uma visão geral da organização vascular da retina. Além disso, usando…

Discussion

O método aqui apresentado oferece uma maneira simples e eficaz para obter imagens das preparações de montagem de retinas inteiras coradas neonatais de rato, tornando-se um modelo facilmente quantificáveis ​​e fisiologicamente relevante da angiogénese. Inicialmente, o olho do rato pode ser bastante difícil para dissecar devido ao seu pequeno tamanho e forma do globo, então um pouco de prática e boas ferramentas de dissecação são necessários para obter resultados confiáveis. Dissecação de olhos preparad…

Materials

			Material
Plastic pipettes 3 ml	Scientific Laboratory Supplies	PIP4210	Remove tip with scissors to create a wide bore
BD Falcon 24-well plates	Scientific Laboratory Supplies	353226
Select Petri dishes TV 90 mm	Scientific Laboratory Supplies	SLS2002
Histobond slides	VWR	631-0624
Coverslips 22 x 22 mm	VWR	631-1336
Dumont Tweezers #5	World precision instruments	14095
Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades	World precision instruments	501235	Used for enucleation
Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips	World precision instruments	500086	Used for dissecting retina
Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips	World precision instruments	501778	Used for dissecting retina
crystal clear’ tubes 2 ml	Starlab	E1420-2000
			Reagents
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S0876	PBS reagent
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5655	PBS reagent
Sodium chloride	Sigma	S9625	PBS reagent
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	Make up in 2x PBS and store at -20 °C
BSA	Sigma	A7638
Triton X-100	Sigma	T9284
Donkey serum	Sigma	D9663
Goat serum	Vector	S-1000
Prolong Gold anti-fade reagent	Invitrogen	P36930	Mounting reagent
Isolectin GS-IB4-alexa 594	Invitrogen	I21413	Use at 1:200 dilution
Isolectin GS-IB4-alexa 488	Invitrogen	I21411	Use at 1:200 dilution
			Primary Antibodies
Anti-NG2 (rabbit polyclonal )	Millipore	AB5320	Detects pericytes
Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal)	Millipore	MAB360	Detects astrocytes
Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal)	Millipore	04-585	Detects pericytes
Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal )	Chemicon	AB756P	Detects vascular basement membrane
Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal)	Sigma	C6198	Detects vascular smooth muscle cells.
Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal)	BD Pharmingen	550546	Detects endothelial cells
Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal)	BD Pharmingen	553370	Detects endothelial cells
Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal)	BD Pharmingen	550548	Detects endothelial cell junctions
Anti-Alk1 (goat polyclonal)	R&D Systems	AF770	Detects endothelial cells
			Secondary Antibodies
Goat anti-rabbit-Alexa594	Invitrogen	A11012	All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa488	Invitrogen	A11006	All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa594	Invitrogen	A11007	All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-mouse-Alexa488	Invitrogen	A11029	All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Donkey anti-goat-Alexa594	Invitrogen	A11058	All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
			Microscopes
Dissection microscope	Zeiss	Stemi SV6
Camera	Zeiss	Axiocam HRc	Camera for dissection microscope
Epifluorescent Microscope	Zeiss	Axioimager with Apotome
Camera	Zeiss	Axiocam HRm	Camera for Axioimager
Confocal Microscope	Nikon	A1R