Den neonatala mus näthinnan ger en väl karakteriserad fysiologisk modell av angiogenes, vilket möjliggör undersökningar av rollerna av olika gener eller läkemedel som modulerar angiogenes i en<em> In vivo</em> Sammanhang. Immunfluorescensfärgning att exakt visualisera vaskulära plexus är avgörande för framgången för dessa typer av studier.
Angiogenes är den komplexa processen av nya blodkärl som definieras av groning av nya blodkärl från en redan existerande kärl nätverk. Angiogenes spelar en viktig roll inte bara i normal utveckling av organ och vävnader, men också i många sjukdomar där blodkärl är oreglerad, såsom cancer, blindhet och ischemiska sjukdomar. I vuxenlivet, blodkärl är i allmänhet stilla så angiogenes är ett viktigt mål för nya läkemedel utveckling att försöka reglera kärlnybildning specifikt i sjukdomen. För att bättre förstå angiogenes och att utveckla lämpliga strategier för att reglera det, är modeller krävs att spegla de olika biologiska steg som är involverade. Musen neonatal näthinnan är en utmärkt modell av angiogenes eftersom artärer, vener och kapillärer utvecklas för att bilda en vaskulär plexus under den första veckan efter födseln. Denna modell har också fördelen av att ha en två-didimensionell (2D) struktur gör analysen enkel jämfört med den komplexa 3D anatomi andra vaskulära nätverk. Genom att analysera den retinal vaskulär plexus vid olika tidpunkter efter födseln, är det möjligt att följa de olika stadierna av angiogenes under mikroskop. Denna artikel visar ett enkelt förfarande för att analysera kärlsystemet av en mus näthinnan med fluorescerande färgning med isolectin och vaskulär specifika antikroppar.
Angiogenes är en komplex utvecklingsprocess definieras av bildningen av nya blodkärl från en redan existerande kärl nätverk och regleras av flera signalvägar. Den mest framträdande av dessa är VEGF vägen. VEGF släpps av ischemiska celler och leder till inledandet av angiogena gro i angränsande blodkärl. Den ledande endotelcell från en ny vaskulär sprout är en "spets"-cell, som producerar filopodia att nå ut i riktning mot källan av VEGF, och följs av prolifererande "stjälk" endotelceller. På detta sätt aktiverade endotelceller migrera och proliferera mot ett avaskulärt område där de bildar nya vaskulära rör. För att stabilisera dessa rör för att stödja blodflöde, endotelceller interagera med pericyter och glatta muskelceller, som omger de nya blodkärl 1. Angiogenes är nödvändig för vaskularisering av embryot och växande vävnader. Däremot bidrar det också till många pathological sjukdomar som cancer, medan defekter i angiogenes är associerade med ischemiska sjukdomar. Utvecklingen av effektiva läkemedelsbehandlingar att reglera angiogenes som ett sätt att behandla sjukdomar är därför av stort intresse. Till exempel kommer effektiva anti-angiogena faktorer minska cancertillväxt, medan proangiogena strategier kan användas för att behandla ischemisk sjukdom. Således modeller av angiogenes är viktigt att förstå regleringen av kärlnybildning och för att utveckla nya terapeutiska strategier för att öka eller minska vaskulär tillväxt.
En grundläggande del av angiogenes forskning är valet av en lämplig vaskulär modell. Många in vitro-modeller har utformats för att återge de grundläggande stegen för angiogenes såsom endothelial cell migration, proliferation och överlevnad 2,3. En ofta använd in vitro-analys är bildandet av en grenad nätverk av endotelceller på en Matrigel matris, även om thans är inte specifik för endotelceller, och inte heller det ingår stöd av pericyter eller glatta muskelceller. Bedömning av ex vivo groning angiogenes använda kulturen mus organ såsom embryoid kropp-analysen, den aortaringen analysen och fostrets mellanfot analysen möjliggör analysen av angiogenes av endotelceller i samband med ytterligare stödjande celler. Men de viktigaste begränsningarna av dessa analyser är bristen på blodflödet och regression av fartyg över tiden, vilket ger ett begränsat fönster för analys. Därför, för att förstå regleringen av angiogenes mer exakt, är in vivo-modeller krävs, t.ex. de som utvecklats i musen med subkutant implanterade svampar eller matrigel pluggar, liksom bakbenet ischemi modell. Emellertid är dessa modeller utmanande att analysera på grund av den komplexa 3D arkitekturen i neovessels. Däremot har den zebrafisk embryot visat en utmärkt modell för att visualisera angiogenes i helaorganismen 4. Däremot är musen evolutionärt mycket närmare släkt med människor än zebrafisk, gör musen en önskad modell i många fall. Följaktligen angiogenes av postnatal mus näthinnan utgör en väl karakteriserad metoden för angiogenes forskning. Det ger inte bara en fysiologisk miljö, men också en 2D vaskulär plexus som lätt kan visualiseras med hjälp av lämpliga fluorescerande fläckar. Arkitekturen av fartyget nätverk, endotelial proliferation, groning, perivaskulär cellrekrytering och kärl remodeling kan alla undersökas använder denna teknik.
I neonatal mus näthinnan sker utvecklingen av retinala blodkärl i den första veckan av postnatal liv. Möss, till skillnad från människor, föds blinda och näthinnor bara bli vaskulariserad efter födseln. Retinala kärl uppstår från mitten av näthinnan nära synnerven vid postnatal dag 0 (P0), och de växer av angiogenes att bilda en mycket organiserad vaskulära plexus som når näthinnans periferi med cirka P8 5. Blodkärlen utvecklas på ett karakteristiskt sätt med kapillär plexus successivt växer utåt från optiken skivan mot periferin för att generera ett regelbundet alternerande mönster av artärer och vener med en mellanliggande kapillämätverk. Näthinnans blodkärl ger en idealisk modell för att studera angiogenes eftersom fartygen kan lätt identifieras som de växer i vad som egentligen är ett 2D-plan, vilket gör det relativt lätt att undersöka näthinnans blodkärl i platt-mount preparat 5. Förfarande för isolering av musen neonatal näthinnan för analys av endoteliala responser tip cell under flera timmar ex vivo har rapporterats 6. Alternativt krävs en mer ingående undersökning av hela retinal kärlsystemet och tillhörande vaskulära markörer immunfärgning av fasta näthinnan prover vid olika stadier av utveckling.
Här ger vien detaljerad beskrivning av en tillförlitlig och tekniskt rättfram metod som vi använder för hela montera färgning av murina retinal vaskulär plexus, från den initiala enucleation av postnatal ögat (se även 7) genom färgning protokollen till final avbildning under lupp.
Den metod som presenteras här ger ett enkelt och effektivt sätt att få bilder av färgade hela berget beredningar av neonatala möss näthinnor, vilket gör det till en lätt mätbar och fysiologiskt relevant modell av angiogenes. Inledningsvis kan musen ögat vara ganska svårt att dissekera grund av sin ringa storlek och klot form, så lite träning och goda Dissektionsverktyg behövs för tillförlitliga resultat. Dissektion av ögon framställda i 2x koncentration av PBS är viktigt eftersom detta orsakar en lite…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats av Wellcome Trust och den brittiska Heart Foundation.
Material | |||
Plastic pipettes 3 ml | Scientific Laboratory Supplies | PIP4210 | Remove tip with scissors to create a wide bore |
BD Falcon 24-well plates | Scientific Laboratory Supplies | 353226 | |
Select Petri dishes TV 90 mm | Scientific Laboratory Supplies | SLS2002 | |
Histobond slides | VWR | 631-0624 | |
Coverslips 22 x 22 mm | VWR | 631-1336 | |
Dumont Tweezers #5 | World precision instruments | 14095 | |
Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades | World precision instruments | 501235 | Used for enucleation |
Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips | World precision instruments | 500086 | Used for dissecting retina |
Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips | World precision instruments | 501778 | Used for dissecting retina |
crystal clear’ tubes 2 ml | Starlab | E1420-2000 | |
Reagents | |||
Sodium phosphate dibasic | Sigma | S0876 | PBS reagent |
Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | PBS reagent |
Sodium chloride | Sigma | S9625 | PBS reagent |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Make up in 2x PBS and store at -20 °C |
BSA | Sigma | A7638 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
Donkey serum | Sigma | D9663 | |
Goat serum | Vector | S-1000 | |
Prolong Gold anti-fade reagent | Invitrogen | P36930 | Mounting reagent |
Isolectin GS-IB4-alexa 594 | Invitrogen | I21413 | Use at 1:200 dilution |
Isolectin GS-IB4-alexa 488 | Invitrogen | I21411 | Use at 1:200 dilution |
Primary Antibodies | |||
Anti-NG2 (rabbit polyclonal ) | Millipore | AB5320 | Detects pericytes |
Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal) | Millipore | MAB360 | Detects astrocytes |
Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal) | Millipore | 04-585 | Detects pericytes |
Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal ) | Chemicon | AB756P | Detects vascular basement membrane |
Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal) | Sigma | C6198 | Detects vascular smooth muscle cells. |
Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal) | BD Pharmingen | 550546 | Detects endothelial cells |
Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal) | BD Pharmingen | 553370 | Detects endothelial cells |
Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal) | BD Pharmingen | 550548 | Detects endothelial cell junctions |
Anti-Alk1 (goat polyclonal) | R&D Systems | AF770 | Detects endothelial cells |
Secondary Antibodies | |||
Goat anti-rabbit-Alexa594 | Invitrogen | A11012 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
Goat anti-rat-Alexa488 | Invitrogen | A11006 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
Goat anti-rat-Alexa594 | Invitrogen | A11007 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
Goat anti-mouse-Alexa488 | Invitrogen | A11029 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
Donkey anti-goat-Alexa594 | Invitrogen | A11058 | All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C. |
Microscopes | |||
Dissection microscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
Camera | Zeiss | Axiocam HRc | Camera for dissection microscope |
Epifluorescent Microscope | Zeiss | Axioimager with Apotome | |
Camera | Zeiss | Axiocam HRm | Camera for Axioimager |
Confocal Microscope | Nikon | A1R |