Het verbeteren van de slaagkans van eiwitkristallisatie door Random Microseed Matrix Screening

Summary

Hier beschrijven we een algemene methode voor willekeurige microseed matrix screening. Deze techniek is een significante toename van de slaagkans van eiwitkristallisatie screeningsexperimenten, de behoefte aan optimalisatie en een betrouwbare aanvoer van kristallen voor gegevensverzameling en ligand-inweken experimenten.

Abstract

Random microseed matrix screening (RMM) is een proteïne kristallisatie techniek waarbij zaad kristallen worden toegevoegd aan willekeurige schermen. Door het verhogen van de kans dat kristallen groeien in de metastabiele zone van een proteïne fasediagram, worden extra kristallisatie leidt vaak verkregen, de kwaliteit van de geproduceerde kristallen worden verhoogd, en een goede kristaltoevoer voor gegevensverzameling en weken experimenten voorzien. Hier beschrijven we een algemene werkwijze voor RMM die kunnen worden toegepast op zowel zittende druppel of opknoping druppel dampdiffusie experimenten, met de hand of met vloeistofverwerking robotica, in 96-well of 24-wells formaat opgesteld.

Introduction

Vanaf de eerste toepassing ervan door Perutz, Kendrew en collega's bij het bepalen van de structuur van hemoglobine en myoglobine, aan de moderne high throughput geautomatiseerde pijpleidingen van de structurele genomics consortia heeft macromoleculaire X-ray kristallografie ons bood een ongekende structurele kijkje in het eiwit wereld . Deze techniek blijft de meest toepasselijke experimentele methode die de directe visualisatie van eiwitstructuur toelaat op atomaire, of in de buurt van atomaire resolutie (dwz in de 1-3 een Range). Voorwaarde voor röntgendiffractie worden toegepast op een eiwit dat eerst moet worden gekristalliseerd, en het is deze fase van het proces dat zich de grootste snelheidsbeperkende stap in structuurbepaling door diffractiemethodes ^{1, 2} blijft. Ondanks de aanzienlijke vooruitgang in ons begrip van het proces van proteïne kristallisatie, en belangrijke verbeteringen in de kwaliteit en beschikbaarheid van kristallisatie-schermen,laden en aanverwante technologieën blijft het onmogelijk om de kans op succes kristallisatie ³ betrouwbaar voorspellen. Biochemische en biofysische methoden kunnen worden toegepast om te beoordelen of een eiwit van interesse displays gunstige eigenschappen voor kristalkernvorming en groei, dus is het goed gevouwen, homogene, monodispers, enz., maar deze inzichten op geen enkele manier zorgen voor een definitieve voorspeller van kristallisatie geneigdheid.

Kiemen lang beweerd een haalbare werkwijze voor het verbeteren van het aantal, de grootte en kwaliteit van de bestaande kristallen of kristallijn materiaal ^4-7 zijn. Deze benadering is gebaseerd op het uitgangspunt dat een voorwaarde dat nucleatie ondersteunt niet optimaal voor verdere kristalgroei en vice versa kunnen worden. Door de overdracht van een kern materiaal van de ene toestand naar de andere, kan men proberen om effectief te ontkoppelen deze processen, waardoor de toegang tot nieuwe, nog onontgonnen kristallisatie ruimte,en als gevolg een verbetering van de slaagkans van een screening experiment. Gevestigde methoden zijn beschreven voor (i) macroseeding, de overdracht van een enkel kristal in zijn geheel aan een toestand naar de andere ^8, (ii) strook zaaien, de overdracht van kernen materiaal, algemeen verkregen door toepassing van gerichte druk met bijvoorbeeld een kat snorhaar op het oppervlak van een bestaande kristal, gevolgd door achtereenvolgende passage van de snorhaar door een nieuwe kristallisatie druppel ^9, en (iii) "klassieke" microseeding, de overdracht van kristal "zaden", gegenereerd door oogsten gemalen kristallen (of kristallijn materiaal), in soortgelijke omstandigheden dat de zaden ¹⁰ opgeleverd. Met name alle drie van deze methoden zijn tijdrovend en slecht schaalbaar, zeker in vergelijking met wat haalbaar moderne vloeistofverwerking kristallisatie robotica. Deze factoren hebben bijgedragen, op een bepaald niveau althans de perceptie dat zaading is een methode om alleen te bezoeken wanneer andere methoden hebben gefaald vruchten af ​​te werpen.

Random matrix microseeding (RMM) is een recente methodologische innovatie die de voordelen van de traditionele microseeding met die van high throughput screening en schaalbaarheid ^11-13 combineert. Deze aanpak berust op het genereren van een uitgangsmateriaal, uit kernhoudende kristallijn materiaal, dat kan worden verdeeld in / op elke sub-well/coverslip bij een standaard 96-toestand kristallisatie scherm. Deze methode is van toepassing op zowel zittend of opknoping druppel dampdiffusie experimenten, met de hand of met behulp van liquid handling robotica, in 24-well of 96-wells formaat vastgesteld. RMM is experimenteel aangetoond aanzienlijk te verhogen kristallisatie succes en produceren kristallen groter diffractie kwaliteit en kwantiteit ^{11, 13, 14,} en vormt een innovatief hulpmiddel in het arsenaal van de kristallografen "benaderingen in de oNgoing streven naar kristallisatie succes. Hier beschrijven we een algemene werkwijze voor RMM en zorgen voorbeeldgegevens illustreert de effectiviteit van deze techniek.

Protocol

1. Strategische overwegingen De keuze van zaad kristallen voor microseeding experimenten zal variëren afhankelijk van het doel van het experiment. Aan het begin van een project is het nuttig om verschillende kristallisatie hits die alternatieve aanknopingspunten kan bieden voor optimalisatie kristal te vinden. RMM reduceert de noodzaak van kristal optimalisatie omdat goede kwaliteit kristallen hebben meer kans om te groeien in de metastabiele zone van het fasediagram, dat wil zeggen in het gebied wa…

Representative Results

(A) Voorbeeld van een RMM experiment Om de effectiviteit van RMM screening tonen we aan deze methode toegepast op de kristallisatie van lysozym van kippeneiwit (HEWL) en runderlever catalase (BLC). Beide enzymen zijn bij uitstek kristalliseerbaar en zijn structureel goed gekarakteriseerd doelstellingen 15, 16. Als zodanig bieden beide uitstekende proefpersonen waarmee de verbeterde kristallisatie succes haalbaar met RMM illustreren. Kristallisatie experimenten werden opgericht in 96-…

Discussion

In dit artikel hebben we een algemene methode voor RMM eiwitkristallisatie screening beschreven. We hebben aangetoond middels twee testeiwitten een significante verbetering in kristallisatie succes met deze methode. Diffractie analyse met behulp van synchrotronstraling uit een subset van kristallen gegenereerd met behulp RMM en niet-RMM methoden geopenbaard weinig variatie in kwaliteit tussen diffractie kristallen gegroeid bij procedure, vroegere auteurs rapporteerden dat goede kwaliteit kristallen vaker groeien in RMM …

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
MRC 96 well crystallization trays	Molecular Dimensions Ltd	MD11-00-100	Non-UV compatible, for screens established by robot
ClearView sealing sheets	Molecular Dimensions Ltd	MD6-01S
Hen egg white lyzozyme	Sigma-Aldrich	L6876	~95% purity
Bovine liver catylase	Sigma-Aldrich	C9322	>95% purity
Xylanase	Hampton Research	HR7-104
Thaumatin from Thaumatococcus daniellii	Sigma-Aldrich	T7630
Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko	Sigma-Aldrich	P1512
JCSG-plus HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-40	For screens established by robot
PACT premier HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-36	For screens established by robot
Morpheus HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-47	For screens established by robot
Crystal Phoenix liquid handling system	Art Robbins Instruments	602-0001-10
Seed bead kit	Hampton Research	HR2-320
Binocular stereo microscope	Leica	M165C
Scalpel blades	Sigma-Aldrich	S2646-100EA
ErgoOne 0.1-2.5 μl pipette	Starlab	S7100-0125
ErgoOne 2-20 μl pipette	Starlab	S7100-0221
ErgoOne 100-1000 μl pipette	Starlab	S7100-1000
JCSG-plus screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-37	For screens established by hand
PACT premier screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-29	For screens established by hand
Morpheus screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-46	For screens established by hand
Tweezers	Sigma-Aldrich	T5415-1EA
CrystalClene coverslips 18 mm	Molecular Dimensions Ltd	MD4-17
2 ml glass Pasteur pipettes	Sigma-Aldrich	Z722669
Vortex mixer	Fisher Scientific	02-215-360
24 well XRL crystallization tray	Molecular Dimensions Limited	MD3-11	For screens established by hand
30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5
20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5
20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0