提高蛋白质结晶的成功率随机Microseed矩阵筛选
Summary
在这里，我们描述了随机microseed矩阵筛选的一般方法。这种技术被示为显著增加的蛋白质结晶筛选实验的成功率，减少需要优化，并提供晶体的数据收集和配体浸泡实验的可靠供应。
Abstract
随机microseed基质筛选（RMMS）是在其中晶种加入到随机屏幕的蛋白质结晶技术。通过增加晶体蛋白质的相图介稳区将增长的可能性，额外的结晶导线通常获得的，所产生的晶体的质量可能会增加，并提供晶体数据收集和浸泡实验的良好供应。这里我们描述了可应用于任一坐滴或悬滴蒸气扩散实验中，通过手或使用液体处理机器人，在96孔或24孔盘格式建立RMMS的一般方法。
Introduction
由佩鲁茨，肯德鲁和同事在确定血红蛋白和肌红蛋白的结构，在结构基因组学财团的现代高通量自动化流水线及其初步应用，大分子X射线晶体学已为我们提供了前所未有的结构性一窥世界的蛋白质。这种技术仍然是最广泛应用的实验方法，允许蛋白质结构的直接可视化在原子，或接近原子分辨率（ 即在1-3的范围内）。一个先决条件被应用到的蛋白质X-射线衍射是，它必须首先被结晶化，这是此阶段中残留的结构确定的一个最大限速步骤由衍射方法1，2的过程。尽管在我们的理解蛋白质结晶的方法，并且在结晶画面的质量和可用性的重大改进显著进步，托盘，以及相关的技术，但它仍然无法可靠地预测结晶成功3的可能性。生物化学和生物物理方法可用于评估是否感兴趣显示器的蛋白质晶体成核和生长良好的特性， 即它是良好的折叠，均匀的，单分散性等，然而，在没有办法这些见解提供结晶的最终的预测倾向。
播种长期以来一直声称是用于改善的数目，大小，和现有的晶体或结晶材料4-7的质量的可行方法。这种方法是基于的前提是，支持晶体成核的条件可能不是最优的用于随后的晶体生长，反之亦然。通过将核物质从一种状态到另一种，人们可能试图有效地分离这些过程，以新的，迄今未开发的结晶太空，使访问，并因此增加在筛选试验的总体成功率。建立的方法已被记录为（ⅰ）macroseeding，其全部的单晶从一个状态转移到另一个8，（ⅱ）条纹播种，核材料的转移，通常由定向的压力，例如，用应用程序得到猫的晶须到现有的晶体，然后通过随后的晶须的通路通过一个新的结晶降9，以及（iii）“经典的”microseeding的表面的晶体“种子”，以收获所产生的传输结晶粉碎物（或结晶性材料），到类似的，产生的种子10的条件。值得注意的是所有这三种方法都是费时和可扩展性很差，当然在比较什么是可以实现的现代化液体处理机器人技术的结晶。这些因素促成，在一定程度上，至少，在人们认为种子ING是一种方法，只访问时，其他方法都未能见效。
随机矩阵microseeding（RMMS）是最近的创新方法，结合了传统microseeding与高通量筛选和可扩展性11-13的好处。这种方法依赖于生成器的种子的库存，从核的结晶材料，其可以在一个标准的96条件结晶屏等分入/到每个sub-well/coverslip生产。此方法适用于两个坐或悬滴蒸气扩散实验中，通过手或使用液体处理机器人，在24孔或96孔盘格式建立。 RMMS已经通过实验证实，以显著提高结晶的成功率，并产生更大的衍射质量和数量11，13，14的晶体，并代表了晶体学家“在邻方法阿森纳一种创新的工具ngoing对结晶成功的努力。在这里，我们描述了用于RMMS的一般方法，并提供采样数据表示该技术的有效性。
Protocol
Representative Results
Discussion
在本文中，我们描述了RMMS蛋白质结晶筛选的一般方法。使用两个测试蛋白质一个显著增强的结晶成功率用这种方法我们已经证明。使用使用RMMS和非RMMS方法产生的结晶的一个子集的同步加速器辐射衍射分析表明使用任一方法生长，虽然以前的作者已报道，良好品质的晶体更容易在RMMS实验11生长晶体间偏差小衍射质量， 13。 HEWL和背光补偿可能给非典型的结果，因为他们特别容易结?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由BBSRC（BB/1006478/1）的部分资助。 PRR是英国皇家学会大学研究奖学金的获得者。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| MRC 96 well crystallization trays | Molecular Dimensions Ltd | MD11-00-100 | Non-UV compatible, for screens established by robot |
| ClearView sealing sheets | Molecular Dimensions Ltd | MD6-01S | |
| Hen egg white lyzozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | ~95% purity |
| Bovine liver catylase | Sigma-Aldrich | C9322 | >95% purity |
| Xylanase | Hampton Research | HR7-104 | |
| Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | T7630 | |
| Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko | Sigma-Aldrich | P1512 | |
| JCSG-plus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-40 | For screens established by robot |
| PACT premier HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-36 | For screens established by robot |
| Morpheus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-47 | For screens established by robot |
| Crystal Phoenix liquid handling system | Art Robbins Instruments | 602-0001-10 | |
| Seed bead kit | Hampton Research | HR2-320 | |
| Binocular stereo microscope | Leica | M165C | |
| Scalpel blades | Sigma-Aldrich | S2646-100EA | |
| ErgoOne 0.1-2.5 μl pipette | Starlab | S7100-0125 | |
| ErgoOne 2-20 μl pipette | Starlab | S7100-0221 | |
| ErgoOne 100-1000 μl pipette | Starlab | S7100-1000 | |
| JCSG-plus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-37 | For screens established by hand |
| PACT premier screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-29 | For screens established by hand |
| Morpheus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-46 | For screens established by hand |
| Tweezers | Sigma-Aldrich | T5415-1EA | |
| CrystalClene coverslips 18 mm | Molecular Dimensions Ltd | MD4-17 | |
| 2 ml glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | Z722669 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-360 | |
| 24 well XRL crystallization tray | Molecular Dimensions Limited | MD3-11 | For screens established by hand |
| 30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
| 20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
| 20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0 |
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