Rastgele Microseed Matrix ELEME Protein Belirginleşmesine Başarı Oranı artırma
Summary
Burada, rasgele microseed matris taraması için genel bir yöntem açıklanmaktadır. Bu tekniğin önemli, protein kristalleşme tarama deneylerin başarı oranını artırmak için optimizasyon ihtiyacını azaltır ve veri toplama ve ligand-ıslatma deneyler için kristaller güvenilir bir kaynağı sağlamak için gösterilmiştir.
Abstract
Rasgele microseed matris taraması (RMMler) tohum kristalleri rasgele ekranlar ilave edildiği bir protein kristalleştirme tekniktir. Kristaller, bir protein faz diyagramının metastabl bölgede büyüyecek olasılığını artırarak, ilave kristalizasyon yol genellikle üretilen kristallerin kalitesi artırılabilir, elde edilir ve veri toplama ve ıslatma deneyler için kristallerinin iyi bir besleme sağlanır. Burada el ile ya da 96-kuyu veya 24-çukurlu tabla formatında, sıvı kullanım robotları ile ya da kurulmuş damla oturma veya asılı damla buharı difüzyon deneyleri, ya da uygulanabilir RMMler için genel bir yöntem açıklanmaktadır.
Introduction
Perutz, Kendrew ve yapısal genomik konsorsiyumların, modern yüksek kapasiteli otomatik boru hatları, hemoglobin ve miyoglobin yapılarını belirlemede işçiler ile ilk uygulamadan, makromoleküler X-ışını kristalografisi bize protein dünyasına görülmemiş bir yapısal bir bakış tanınan vardır . Bu teknik, atom at protein yapısının doğrudan görselleştirme izin en yaygın uygulanan deneysel yöntem kalır, ya da (yani 1-3 Å aralığında) atomik çözünürlükte yakın. Bir proteine uygulanacak X-ışını difraksiyonu için bir ön gereklilik, ilk kristalize olması gerektiğini, ve bu kırınım yöntem 1, 2 ile yapı belirlenmesinde büyük tek oran-sınırlayıcı aşama kaldığı işlemin bu aşamasıdır. Bizim protein kristalleştirme sürecinin anlaşılması ve kristalizasyon ekranlarının kalitesi ve kullanılabilirliği önemli gelişmeler önemli gelişmelere rağmen,tepsiler ve ilgili teknolojiler, güvenilir kristalleşme başarının 3 olasılığını tahmin etmek imkansız kalır. Biyokimyasal ve Biyofiziksel yöntemler ilgi görüntüler bir kristal protein çekirdeklenme ve büyüme için elverişli özellikleri, yani iyi katlanmış, homojen, tek dağılımlı, vs olup olmadığını değerlendirmek için uygulanabilir, ancak, hiçbir şekilde bu anlayış kristalleşme kesin bir belirleyici sağlamak eğilimi.
Tohum uzun mevcut kristal veya kristal malzemenin 4-7 sayısı, boyutu ve kaliteyi artırmak için uygun bir yöntem olduğu iddia edilmiştir. Bu yaklaşım kristal çekirdeklenmesini destekleyen bir durumdur sonraki kristal büyümesi ve tersi için optimal olmayabilir önermesine dayanır. Başka bir durum nucleatedi malzemeyi aktararak, kimse, bu süreçlerin etkin ayrılabilmesi için yeni, henüz keşfedilmemiş kristalleşme alanı böylece veren erişimi deneyebilirve bunun sonucu olarak bir tarama deneyinin genel başarı oranı artmaktadır. Kurulan yöntemleri, genellikle, örneğin kullanılarak yönlü basınç uygulaması ile elde edilen (i) macroseeding, bir 8 bir durum bütünüyle tek bir kristalin transferi, (ii) bir çizgi ekim, çekirdekli malzeme transferi için belgelenmiştir Yeni bir kristalizasyon damla 9, ve (iii) "klasik" mikro-ile bıyık sonraki geçişi ve ardından var olan bir kristal, yüzeyine bir kedi bıyık, hasat tarafından üretilen kristal "tohum", transfer kristaller (ya da kristal halinde ezilmiş Tohumlar 10 vermiştir benzer koşullar malzemesi). Özellikle bu yöntemlerin her üç örneği, modern sıvı kullanım kristalleştirme ile elde robotik ne göre, zaman alıcı ve kötü ölçeklenebilir. Bu faktörler algı, en azından belli bir düzeyde, katkıda bu tohuming diğer yaklaşımlar meyvelerini başarısız olduğunda, yalnızca ziyaret edilecek bir yöntemdir.
Rasgele matris mikro-(RMMler) yüksek verimli tarama ve ölçeklenebilirlik 11-13 olanlar ile geleneksel mikro-avantajlarını birleştiren yeni bir metodolojik bir yeniliktir. Bu yaklaşım, bir standart 96-durum kristalleşme ekran içinde her sub-well/coverslip üzerine / içine örnek edilebilir çekirdekli kristal bir malzemeden üretilen bir tohum stoku nesil dayanır. Bu yöntem, her iki el ile ya da 24-kuyu veya 96-çukurlu tabla formatında, sıvı kullanım robotları ile ya da kurulmuş damla buharı difüzyon deneyleri, oturma ya da asılı için de geçerlidir. RMMler önemli ölçüde kristalleşme başarı oranını artırmak ve daha fazla kırınım kalite ve miktar 11, 13, 14 kristallerini üretmek için deneysel olarak gösterdi, ve o de yaklaşımların crystallographers 'cephanelik yeni bir araç temsil edilmiştirkristalleşme başarı yolunda çaba ngoing. Burada RMMler için genel bir yöntem açıklanmaktadır ve bu tekniğin etkinliğini gösteren örnek veriler sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda RMMler protein kristalleşme taraması için genel bir yöntem tanımlanmıştır. Bu yöntemi kullanarak, iki test proteinleri kristalleşme başarı oranında önemli bir artış ile göstermiştir. RMMler olmayan RMMler yöntemlerle üretilen kristaller bir alt kümesi senkrotron radyasyonu kullanılarak kırınım analizi, önceki yazarlar iyi kalitede kristaller RMMler deneylerde 11 büyümeye daha fazla olduğunu rapor olmasına rağmen, her iki yöntemi kullanılarak yetiştirilir…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma BBSRC (BB/1006478/1) tarafından kısmen finanse edildi. PRR Royal Society Üniversitesi Araştırma Bursu almıştır.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| MRC 96 well crystallization trays | Molecular Dimensions Ltd | MD11-00-100 | Non-UV compatible, for screens established by robot |
| ClearView sealing sheets | Molecular Dimensions Ltd | MD6-01S | |
| Hen egg white lyzozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | ~95% purity |
| Bovine liver catylase | Sigma-Aldrich | C9322 | >95% purity |
| Xylanase | Hampton Research | HR7-104 | |
| Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | T7630 | |
| Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko | Sigma-Aldrich | P1512 | |
| JCSG-plus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-40 | For screens established by robot |
| PACT premier HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-36 | For screens established by robot |
| Morpheus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-47 | For screens established by robot |
| Crystal Phoenix liquid handling system | Art Robbins Instruments | 602-0001-10 | |
| Seed bead kit | Hampton Research | HR2-320 | |
| Binocular stereo microscope | Leica | M165C | |
| Scalpel blades | Sigma-Aldrich | S2646-100EA | |
| ErgoOne 0.1-2.5 μl pipette | Starlab | S7100-0125 | |
| ErgoOne 2-20 μl pipette | Starlab | S7100-0221 | |
| ErgoOne 100-1000 μl pipette | Starlab | S7100-1000 | |
| JCSG-plus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-37 | For screens established by hand |
| PACT premier screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-29 | For screens established by hand |
| Morpheus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-46 | For screens established by hand |
| Tweezers | Sigma-Aldrich | T5415-1EA | |
| CrystalClene coverslips 18 mm | Molecular Dimensions Ltd | MD4-17 | |
| 2 ml glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | Z722669 | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-360 | |
| 24 well XRL crystallization tray | Molecular Dimensions Limited | MD3-11 | For screens established by hand |
| 30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
| 20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
| 20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0 |
References
- Bergfors, T. Protein Crystallization. IUL Biotechnology Series. , (2009).
- Rupp, B. . Biomolecular Crystallography: Priciples, Practice and Application to Structural Biology. , (2010).
- Babnigg, G., Joachimiak, A. Predicting protein crystallization propensity from protein sequence. J. Struct. Funct. Genomics. 11 (1), 71-80 (2010).
- Bergfors, T. Seeds to crystals. J. Struct. Biol. 142 (1), 66-76 (2003).
- Ireton, G. C., Stoddard, B. L. Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60, 601-605 (2004).
- Zhu, D. Y., Zhu, Y. Q., et al. Optimizing protein crystal growth through dynamic seeding. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 61 (Pt 6), 772-775 (2005).
- Bergfors, T. Screening and optimization methods for nonautomated crystallization laboratories. Methods Mol. Biol. 363, 131-151 (2007).
- Xu, L., Butcher, S. J., et al. Crystallization and preliminary X-ray analysis of receptor-binding protein P2 of bacteriophage PRD1. J. Struct. Biol. 131 (2), 159-1563 (2000).
- Rangarajan, E. S., Izard, T. Improving the diffraction of full-length human selenomethionyl metavinculin crystals by streak-seeding. Acta. Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 66 (Pt 12), 1617-1620 (2010).
- Kadirvelraj, R., Harris, P., et al. A stepwise optimization of crystals of rhamnogalacturonan lyase from Aspergillus aculeatus. Acta. Crystallogr. D. Biol . Crystallogr. 58 (Pt 8), 1346-1349 (2002).
- D’Arcy, A., Villard, F., et al. An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 63 (Pt 4), 550-554 (2007).
- Shaw Stewart, P. D., Kolek, S. A., et al. Random Microseeding: A Theoretical and Practical Exploration of Seed Stability and Seeding Techniques for Successful Protein Crystallization. Crystal Growth & Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).
- Obmolova, G., Malia, T. J., et al. Promoting crystallization of antibody-antigen complexes via microseed matrix screening. Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 927-933 (2010).
- Villasenor, A. G., Wong, A., et al. Acoustic matrix microseeding: improving protein crystal growth with minimal chemical bias. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 5), 568-5676 (2010).
- Strynadka, N. C., James, M. N. Lysozyme: a model enzyme in protein crystallography. EXS. 75, 185-222 (1996).
- Diaz, A., Loewen, P. C., et al. Thirty years of heme catalases structural biology. Arch. Biochem. 525 (2), 102-110 (2012).
