Här beskriver vi en generell metod för slump microseed matrisscreening. Denna teknik har visat sig signifikant öka andelen framgångsrika proteinkristallisescreeningexperiment, minska behovet av optimering, och ge en tillförlitlig leverans av kristaller för datainsamling och ligand-blötläggningsförsök.
Slumpmässig microseed matris screening (RMM) är ett protein kristal teknik där ympkristaller sättes till slumpmässiga skärmar. Genom att öka sannolikheten för att kristallerna kommer att växa i den metastabila zonen av ett proteins fasdiagram, är extra kristallisa leder ofta erhållits, kvaliteten på kristaller som produceras kan ökas, och ett bra utbud av kristaller för datainsamling och blötläggningsförsök tillhandahålls. Här beskriver vi en generell metod för riskhanteringsåtgärder som kan tillämpas på antingen sittande droppe eller hängande droppångdiffusion experiment som fastställs antingen för hand eller med hjälp av flytande robothantering i 96-brunn eller 24-brunnar format.
Från sin ursprungliga ansökan genom Perutz, Kendrew och medarbetare i att bestämma strukturerna för hemoglobin och myoglobin, till de moderna med hög genomströmning automatiserade rörledningar av Structural Genomics konsortier har makromolekylär röntgenkristallografi gav oss en enorm strukturell inblick i protein världen . Denna teknik är fortfarande den mest tillämplig experimentell metod som tillåter direkt visualisering av proteinstrukturen på atomär eller nära atomär upplösning (dvs. inom 1-3 en rad). En förutsättning för röntgendiffraktion som skall tillämpas på ett protein är att det först måste kristalliseras, och det är detta skede av processen som förblir den största enskilda hastighetsbegränsande steget i strukturbestämning genom diffraktion metoderna 1, 2. Trots betydande framsteg i vår förståelse av processen för proteinkristallisering, och stora förbättringar av kvaliteten och tillgången på kristallisa skärmar,korgar och relaterad teknik, är det fortfarande omöjligt att tillförlitligt förutsäga sannolikheten för kristallise framgång 3. Biokemiska och biofysikaliska metoder kan tillämpas för att bedöma om ett protein av intresse visar gynnsamma egenskaper för kristallkärnbildning och tillväxt, är dvs det väl-vikas, homogen, monodispersa, etc, men dessa insikter inte på något sätt ge en definitiv prediktor för kristallisering benägenhet.
Sådd har länge påstods vara en genomförbar metod för att förbättra antal, storlek och kvalitet av befintliga kristaller eller kristallint material 4-7. Denna metod bygger på antagandet att ett tillstånd som stöder kristall kärnbildning kanske inte optimalt för efterföljande kristalltillväxt och vice versa. Genom att överföra kärnmaterial från ett tillstånd till ett annat, kan man försöka att effektivt frikoppla dessa processer, vilket ger tillgång till nya, ännu outforskade kristallise utrymme,och som ett resultat ökar den totala framgång på en screening experiment. Etablerade metoder har dokumenterats för (i) macroseeding, överföring av en enkristall i sin helhet från ett tillstånd till ett annat 8, (ii) strimma seeding, överföring av kärnförsedda material, i allmänhet erhållas genom tillämpning av riktad tryck med användning av till exempel en katts morrhår till ytan av en existerande kristaller, följt av efterföljande passagen av whisker genom ett nytt kristallisa droppe 9, och (iii) "klassiska" microseeding, överföring av kristall "frön", som genereras av skörd krossade kristaller (eller kristallint material), in i betingelser som liknar de som gav fröna 10. Särskilt alla tre av dessa metoder är tidskrävande och dåligt skalbara, särskilt i jämförelse med vad som är möjligt med moderna vätskehanteringskristallise robotik. Dessa faktorer har bidragit, på någon nivå åtminstone, till uppfattningen att utsädening är en metod som endast besökas när andra metoder har misslyckats med att ge resultat.
Slumpmässig matris microseeding (RMMS) är en ny metodologisk innovation som kombinerar fördelarna med traditionell microseeding med de av höghastighetsscreening och skalbarhet 11-13. Detta tillvägagångssätt förlitar sig på alstring av en startkultur, som tillverkas av kärnförsedda kristallina materialet, vilket kan alikvoteras i / på varje sub-well/coverslip i en standard 96-condition kristal skärmen. Denna metod är tillämplig på både sittande eller hängande droppångdiffusion experiment som fastställs antingen för hand eller med hjälp av flytande robothantering i 24-brunn eller 96-brunnar format. riskhanteringsåtgärder har visats experimentellt att avsevärt öka kristallise framgång, och producera kristaller av större diffraktion kvalitet och kvantitet 11, 13, 14, och utgör ett innovativt verktyg i kristallo "arsenal av metoder i oNgoing insats för kristallise framgång. Här beskriver vi en generell metod för RMM och ger exempeldata som visar effektiviteten av denna teknik.
I denna skrift har vi beskrivit ett allmänt förfarande för RMM proteinkristallisascreening. Vi har visat genom att använda två testproteiner en betydande förbättring i kristallise framgång med denna metod. Diffraktion analys med synkrotronljus av en delmängd av kristaller som genereras med hjälp av riskhanteringsåtgärder och icke-RMMS metoder visade liten variation i diffraktion kvalitet mellan kristaller odlas antingen metod, även om tidigare författare har rapporterat att god kvalitet kristaller är mer …
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats delvis av BBSRC (BB/1006478/1). PRR är mottagare av en Royal Society University Research Fellowship.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
MRC 96 well crystallization trays | Molecular Dimensions Ltd | MD11-00-100 | Non-UV compatible, for screens established by robot |
ClearView sealing sheets | Molecular Dimensions Ltd | MD6-01S | |
Hen egg white lyzozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | ~95% purity |
Bovine liver catylase | Sigma-Aldrich | C9322 | >95% purity |
Xylanase | Hampton Research | HR7-104 | |
Thaumatin from Thaumatococcus daniellii | Sigma-Aldrich | T7630 | |
Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko | Sigma-Aldrich | P1512 | |
JCSG-plus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-40 | For screens established by robot |
PACT premier HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-36 | For screens established by robot |
Morpheus HT-96 screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-47 | For screens established by robot |
Crystal Phoenix liquid handling system | Art Robbins Instruments | 602-0001-10 | |
Seed bead kit | Hampton Research | HR2-320 | |
Binocular stereo microscope | Leica | M165C | |
Scalpel blades | Sigma-Aldrich | S2646-100EA | |
ErgoOne 0.1-2.5 μl pipette | Starlab | S7100-0125 | |
ErgoOne 2-20 μl pipette | Starlab | S7100-0221 | |
ErgoOne 100-1000 μl pipette | Starlab | S7100-1000 | |
JCSG-plus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-37 | For screens established by hand |
PACT premier screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-29 | For screens established by hand |
Morpheus screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-46 | For screens established by hand |
Tweezers | Sigma-Aldrich | T5415-1EA | |
CrystalClene coverslips 18 mm | Molecular Dimensions Ltd | MD4-17 | |
2 ml glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | Z722669 | |
Vortex mixer | Fisher Scientific | 02-215-360 | |
24 well XRL crystallization tray | Molecular Dimensions Limited | MD3-11 | For screens established by hand |
30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5 | |||
20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0 |