형광 단백질을 표현 라이브 마우스의 이미징 세포 이하의 구조물의 intravital 현미경
Summary
의 intravital 현미경은 살아있는 동물의 다양한 생물학적 과정을 영상화 할 수있는 강력한 도구입니다. 이 문서에서는, 우리는 살아있는 생쥐의 침샘에서 이러한 분비 과립으로 세포 내 구조의 역학 이미징을위한 자세한 방법을 제시한다.
Abstract
여기에서 우리는 공 초점의 intravital 현미경의 사용을 기반으로 라이브 설치류에 이미지 세포 내 구조에 절차를 설명합니다. 그들은 몇 가지 장점을 제공하기 때문에 모델 기관으로, 우리는 살아있는 생쥐의 침샘을 사용합니다. 첫째, 그들은 쉽게 광학계에 액세스 할 수 있도록 노출, 및 심장 박동과 호흡에 의한 모션 아티팩트의 감소를 용이하게 안정화 될 수있다. 이것은 크게 이미징 및 작은 세포 내 구조를 추적을 용이하게한다. 둘째, 침샘의 세포 인구의 대부분은 장기의 표면에서 액세스 할 수 있습니다. 이는 두 개의 광자 현미경과 같은 생체 내 이미징을 위해 사용 된 다른 기술,보다 높은 공간 해상도를 공 초점 현미경의 사용을 허용한다. 마지막으로, 침샘 쉽게 따라서 분자 수준에서 생물학적 과정을 조사 할 수있는 강력한 시스템을 제공, 약리학 적 및 유전 조작 할 수 있습니다.
이 연구에서 우리는 선방 세포에서 분비 과립의 세포 외 유출 및 분비 과립 베타 – 아드레날린 수용체의 자극에 융합 혀끝의 세포막의 역학의 역학을 수행하도록 설계된 프로토콜에 초점을 맞 춥니 다. 특히, 우리는 세포질의 GFP 및 형광 단백질 탠덤 토마토와 융합 막 대상 펩타이드를 공동으로 표현 형질 전환 마우스를 사용. 그러나, 우리는 침샘을 안정시켜 화상에 사용되는 절차는 다른 마우스 모델로 확장하고 엔도 좀, 리소좀, 미토콘드리아 등 다양한 세포 내 구조의 시각화를 가능하게 생체 내 세포 성분에 라벨을하기위한 다른 방법으로 결합 될 수 있고, 액틴 세포 골격.
Introduction
지난 20 년에 살고있는 현미경의 출현과 형광 단백질의 사용은 따라서 세포 생물학 1에 대한 우리의 이해를 발전, 상상할 수있는 모든 세포 과정에 대한 주요 분야를 이끌고있다. 이 필드는 실험 조작에 관해서 특히 매우 강력한 모델 시스템이다 포유 동물 세포 배양의 사용에서 엄청난 혜택을 받았다. 그러나, 그들은 종종 복잡한 다세포 생물 2의 생물학의 진정한 표현을 제공하지 않습니다. 이 문제는 신경 생물학, 면역학 및 종양 생물학 3 등의 분야에서 중요한 생물 학적 질문 조사에 문을 열었습니다 그의 intravital 현미경 (IVM)의 개발에 의해 해결되기 시작했다. 지금까지, IVM에 기초 연구의 대부분은 세포 내 구획의 동역학에 관한 정보를 제공하지 않고, 조직 및 개개의 세포 수준에서 수행되었다. 최근에, 우리의 실험실 및 기타의 라이브 설치류 4-7, 13-15 및 생체 내에서 약물 및 유전자 조작을 허용 이미징 세포 내 구조 할 수 IVM 기술을 개발했습니다. 이 방법은 생체 내에서 막 인신 매매를 연구하기 위해 우리가 사용하고,보다 구체적으로 이입과 세포 외 유출 6,7를 규제하고있다.
우리의 실험 모델 시스템은 노출 안정화 및 마취 설치류의 턱밑 침샘 (SG를를) 이미징을 기반으로합니다. IVM을위한 모델 기관으로서 SGS의의 선택은 땀샘 부 수술을 수행하여 쉽게 접근 할 수 있다는 사실로 인해, 그들의 생리 기능을 손상시키지 않고 구체화 한 심장 박동과 호흡에 의한 움직임 아티팩트를 감소시키는 안정화 될 수있다. 또한, SGS는 선택적으로 타액 덕트 8,9를 통해 바이러스 성 또는 비 바이러스 성 중 하나를 기반으로 벡터를 주입하여 유전자를 조작 할 수 있습니다. 마지막으로, SGS는 편광 epith 구성 외분비 샘이다꽈리 및 덕트, 근 상피 세포 및 간질 세포의 복잡한 집단을 형성 elial 세포. 이러한 이유로, 그들은 우리의 최근의 연구 (10)에 강조로, 세포 외 유출, 엔도 시토 시스, 유전자 전달, 그리고 말라의 골격을 연구하고 세포 극성, 세포 분열, 세포와 같은 세포 생물학의 측면을 공부할 수있는 기회를 제공 할 수있는 좋은 모델입니다 접합 셀 이온 채널.
본 논문에서 우리는 세부 사항에서 라이브 마우스의 SG를의 상피 세포 이하의 해상도를 달성하기위한 영상 프로토콜을 설명합니다. 특히, 우리는 방법을 규제 세포 외 유출 동안 SG를의 선방 세포에서 이미지 분비 과립에 보여줍니다. 이전에 도시 된 바와 같이, 베타 – 아드레날린 수용체 작용제와 자극에, 분비 과립은 혀끝의 세포막과 융합 점차 축소, 선포 눈물 소관 (6)에 자신의 콘텐츠를 공개. 우리의 목표는 M으로 조사하기위한 기본 도구를 제공하는 것입니다수술 절차 및 동물 취급 inimal 경험, 성공적 세포 이하의 해상도로 IVM을 수행 할 수 있도록. IVM에서 가장 어려운 부분은 동물의 준비를하기 때문에, 우리가 자신의 기능을 손상시키지 않고 SG를 노출하고 무력화하기 위해 사용하는 기본적인 수술 절차의 설명에 초점을 맞 춥니 다. 이러한 조직의 형광 프로브의 전달, 형질 전환 동물의 사용, 또는이 둘의 조합으로 세포 내 구조, 몇 가지 전략을, 레이블하는 절차로, 다른 7,11 설명 하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
지금까지 세포 내 구조는 주로 체외 (즉, 세포 배양) 또는 종종 그대로 살아있는 조직 (6)의 특성을 요점을 되풀이하지 않는 생체 (즉, 장기 배양, 조직 조각, 선포 준비) 모델 시스템의 이미지가되었다. 그것은 살아있는 생쥐의 특정 막 인신 매매 단계 (즉, 규제 세포 외 유출)의 역학을 영상화 할 수 있기 때문에이 점에서, 여기에 제시된 방법은 중요한 돌파구를 나타냅?…
Acknowledgements
이 연구는 NIH의 교내 연구 프로그램, 치과와 두개 안면 연구소의 국립 연구소에 의해 지원되었다.
Materials
| Reagent | |||
| Isoflourane (Forane) | Baxter | 101936-40 | Handle under chemical hood |
| Ketamine (ketaved) | Fort Dodge Animal Health | 57457-034-10 | Stock solution 100 mg/ml |
| Xylazine (Anased) | Akorn, Decatur | 61311-481-10 | Stock solution 100 mg/ml |
| Neomycin/Polymyxin B | Bausch and Lomb | 24208-785-55 | Use to lubricate the eye of the mouse |
| Carbomer-940 | Ashalnd, Inc. | 4607-1 | |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279 | Add drop wise to prevent the solution to solidify |
| Isoproternol | Sigma-Aldrich | 16504 | Prepare fresh solutions in saline when needed. Stocks can be stored at -20 °C |
| Instrument | |||
| Isoflurane V 1.9 (Vaporizer) | Braintree Scientific | 190AF | |
| Portable Downdraft table equipped with HEPA filter | Hazard Technology | PDDT | |
| Heat lamp, Model HL1 | Braintree Scientific | HL-1 US | |
| MicroTherma 2T Thermometer | Braintree Scientific | TW2 | |
| Operating Scissors (11.5 cm straight | World Precision Instruments | 5003708-12 | |
| #7 curved tip tweezers | World Precision Instruments | 14187 | |
| Microscissors | World Precision Instruments | 503365 | |
| Black Braided Silk suture #4.0 | George & Tiemann & Co | 160-1219-4 | |
| Gauze sponges 2″ x 2″ | Tyco Healthcare | 9022 | |
| Lens cleaning tissue | Olympus | CL-TISSUE (M97) AX6476 |
References
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