Intravitale Microscopia per le strutture Imaging subcellulari in topi vivi Esprimere proteine fluorescenti
Summary
La microscopia intravitale è un potente strumento che permette l'imaging vari processi biologici di animali vivi. In questo articolo, presentiamo un metodo dettagliato per l'imaging la dinamica di strutture subcellulari, come granuli secretori, nelle ghiandole salivari di topi vivi.
Abstract
Qui si descrive un procedimento per immagine strutture subcellulari nei roditori vivi che si basa sull'utilizzo di microscopia confocale intravitale. Come modello organo, usiamo le ghiandole salivari di topi vivi quanto forniscono diversi vantaggi. Primo, possono essere facilmente esposti per consentire l'accesso alle ottiche, e stabilizzato per facilitare la riduzione degli artefatti da movimento dovuti il battito cardiaco e la respirazione. Questo facilita notevolmente l'imaging e il monitoraggio di piccole strutture subcellulari. In secondo luogo, la maggior parte delle popolazioni cellulari delle ghiandole salivari sono accessibili dalla superficie dell'organo. Questo permette l'utilizzo di microscopia confocale che ha una risoluzione spaziale di altre tecniche che sono state utilizzate per l'imaging in vivo, come la microscopia a due fotoni. Infine, ghiandole salivari possono essere facilmente manipolati geneticamente e farmacologicamente, fornendo così un sistema robusto per studiare processi biologici a livello molecolare.
In questo studio ci concentriamo su un protocollo progettato per seguire la cinetica di esocitosi di granuli secretori in cellule acinose e la dinamica della membrana plasmatica apicale in cui i granuli secretori fusibile a stimolazione dei recettori beta-adrenergici. In particolare, abbiamo utilizzato un topo transgenico che co-esprime citosolica GFP e un peptide membrana mirata fusa con la proteina fluorescente tandem-pomodoro. Tuttavia, le procedure che abbiamo usato per stabilizzare e l'immagine delle ghiandole salivari può essere esteso ad altri modelli del mouse e accoppiati ad altri approcci per etichettare componenti cellulari in vivo, permettendo la visualizzazione di varie strutture subcellulari, come endosomi, lisosomi, mitocondri, e il citoscheletro di actina.
Introduction
Negli ultimi due decenni, l'avvento della microscopia diretta e l'uso di proteine fluorescenti hanno portato a importanti progressi in ogni processo cellulare immaginabile, facendo progredire la nostra comprensione della biologia cellulare 1. Questo campo ha beneficiato enormemente dall'utilizzo di colture di cellule di mammiferi che sono estremamente potenti sistemi modello, in particolare quando si tratta di manipolazioni sperimentali. Tuttavia, essi spesso non forniscono una rappresentazione fedele della biologia dei complessi organismi pluricellulari 2. Questo problema ha cominciato ad essere affrontati con lo sviluppo della microscopia intravitale (IVM), che ha aperto la porta ad indagare principali questioni biologiche in campi quali la neurobiologia, immunologia e biologia del tumore 3. Finora, la maggior parte degli studi basati su IVM sono state eseguite a livello dei tessuti e cellule individuali, senza fornire alcuna informazione circa la dinamica dei compartimenti subcellulari. Recentemente, il nostro laboratorio e altris hanno sviluppato tecniche di IVM capaci di immagini strutture subcellulari nei roditori vivi 4-7, 13-15 e permettendo manipolazioni farmacologiche e genetiche in vivo. Questo approccio è stato utilizzato da noi per studiare il traffico di membrana in vivo, e più specificamente endocitosi e esocitosi regolata 6,7.
Il nostro sistema modello sperimentale si basa sull'esposizione, la stabilizzazione e l'imaging delle ghiandole salivari sottomandibolare (SGS) di roditori anestetizzati. La scelta del SGs come modello organo per IVM è dovuto al fatto che le ghiandole sono facilmente accessibili eseguendo una chirurgia minore, può essere esteriorizzato senza compromettere la loro fisiologia, e stabilizzato per ridurre gli artefatti da movimento dovuti il battito cardiaco e la respirazione. Inoltre, SGS è selettivamente manipolato geneticamente iniettando vettori basati sia virali o non virali attraverso il condotto salivare 8,9. Infine, SGS sono ghiandole esocrine composte epith polarizzataElial cellule, che formano acini e dotti, cellule mioepiteliali, e conta complesso di cellule stromali. Per questa ragione, sono un ottimo modello per studiare esocitosi, endocitosi, la consegna del gene, e citoscheletro di actina, come evidenziato nei nostri recenti studi 10, e di offrire l'opportunità di studiare aspetti della biologia cellulare come polarità cellulare, divisione cellulare, cellula- giunzioni cellulari e canali ionici.
In questo lavoro descriviamo in dettaglio un protocollo di imaging per il raggiungimento di risoluzione subcellulare nell'epitelio delle SG di un topo vivo. In particolare, mostriamo come immagine granuli di secrezione nelle cellule acinose del SG durante esocitosi regolata. Come precedentemente indicato, dopo stimolazione con agonisti del recettore beta-adrenergico, granuli secretori fondono con la membrana plasmatica apicale e gradualmente collassano, rilasciando il loro contenuto nel canalicoli acinose 6. Il nostro obiettivo è quello di fornire gli strumenti di base per gli investigatori con mesperienza inimal nelle procedure chirurgiche e di trattamento degli animali, in modo da poter eseguire con successo IVM ad una risoluzione subcellulare. Poiché la parte più impegnativa in IVM è la preparazione dell'animale, qui ci concentriamo sulla descrizione delle procedure chirurgiche di base che sono utilizzati per esporre e immobilizzare SGS senza compromettere la loro funzione. Per quanto riguarda le procedure di etichettare strutture subcellulari, diverse strategie, come la distribuzione sistemica di sonde fluorescenti, impiego di animali transgenici, o una combinazione di entrambi, sono state descritte altrove 7,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Finora strutture cellulari sono stati in gran parte ripreso in vitro (cioè colture cellulari) o ex vivo (cioè organo-culture, fette di tessuto, preparazioni acinose) sistemi modello che spesso non ricapitolano le caratteristiche del intatti tessuti vivi 6. A tale riguardo, l'approccio qui presentato rappresenta un importante passo avanti in quanto consente imaging delle dinamiche di una determinata tratta passo membrana (esocitosi cioè regolata) in topi vivente.
<p class=…Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta dal programma di ricerca intramurale del NIH, National Institute of Dental Research e craniofacciale.
Materials
| Reagent | |||
| Isoflourane (Forane) | Baxter | 101936-40 | Handle under chemical hood |
| Ketamine (ketaved) | Fort Dodge Animal Health | 57457-034-10 | Stock solution 100 mg/ml |
| Xylazine (Anased) | Akorn, Decatur | 61311-481-10 | Stock solution 100 mg/ml |
| Neomycin/Polymyxin B | Bausch and Lomb | 24208-785-55 | Use to lubricate the eye of the mouse |
| Carbomer-940 | Ashalnd, Inc. | 4607-1 | |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279 | Add drop wise to prevent the solution to solidify |
| Isoproternol | Sigma-Aldrich | 16504 | Prepare fresh solutions in saline when needed. Stocks can be stored at -20 °C |
| Instrument | |||
| Isoflurane V 1.9 (Vaporizer) | Braintree Scientific | 190AF | |
| Portable Downdraft table equipped with HEPA filter | Hazard Technology | PDDT | |
| Heat lamp, Model HL1 | Braintree Scientific | HL-1 US | |
| MicroTherma 2T Thermometer | Braintree Scientific | TW2 | |
| Operating Scissors (11.5 cm straight | World Precision Instruments | 5003708-12 | |
| #7 curved tip tweezers | World Precision Instruments | 14187 | |
| Microscissors | World Precision Instruments | 503365 | |
| Black Braided Silk suture #4.0 | George & Tiemann & Co | 160-1219-4 | |
| Gauze sponges 2″ x 2″ | Tyco Healthcare | 9022 | |
| Lens cleaning tissue | Olympus | CL-TISSUE (M97) AX6476 |
References
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