Floresan Proteinler ifade Canlı Farelerde Görüntüleme hücrealtı Yapıların Intravital Mikroskopi
Summary
Intravital mikroskopi canlı hayvanlarda çeşitli biyolojik süreçleri görüntüleme sağlayan güçlü bir araçtır. Bu yazıda, canlı farelerde tükürük bezlerinde bu salgılama granüller gibi alt-hücresel yapıların, dinamiklerini görüntüleme için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz.
Abstract
Burada konfokal mikroskopi intravital kullanımına dayanan, canlı kemirgenlerde görüntü hücre içi yapılarda hiç bir yöntem tarif eder. Onlar çeşitli avantajlar sağlamak beri bir model organ olarak, biz canlı farelerin tükürük bezleri kullanın. İlk olarak, kolayca optik erişim sağlamak maruz bırakıldı ve kalp atışı ve solunum nedeniyle hareket eserler azaltılmasını kolaylaştırmak için stabilize edilebilir. Bu durum görüntü ve küçük hücre içi yapıları izleme kolaylaştırır. İkinci olarak, tükürük bezlerinin hücre popülasyonlarının çoğu organın yüzeyinden erişilebilir. Bu, iki foton mikroskopi gibi in vivo görüntüleme için kullanılmış olan diğer teknikler, daha yüksek bir uzamsal çözünürlüğe sahip konfokal mikroskopi kullanımına izin verir. Son olarak, tükürük bezleri kolayca böylece moleküler düzeyde biyolojik süreçleri araştırmak için güçlü bir sistem sağlayarak, farmakolojik ve genetik olarak manipüle edilebilir.
Bu çalışmada akinar hücrelerinde salgılama granüllerin Ekzositoz ve salgı granüller beta-adrenerjik reseptörlerin stimülasyonu üzerine sigorta apikal plazma zarının dinamiklerinin kinetiğini takip etmek için tasarlanmış bir protokol üzerinde odaklanır. Özellikle, sitosolik GFP floresan protein ve tandem-domates ile ikame edilmiş bir membran-hedefli bir peptit birlikte-ifade eden transgenik bir fare kullanılmıştır. Ancak, tükürük bezleri stabilize etmek ve görüntü için kullanılan prosedürler, diğer fare modellerinde uzatıldı ve bu endozomlarda, lizozomlarda, mitokondri gibi çeşitli hücre içi yapıların görselleştirme sağlayan, in vivo hücre bileşenleri etiketlemek için diğer yaklaşımlar akuple edilebilir ve aktin hücre iskeleti.
Introduction
Geçtiğimiz iki yıl içinde canlı mikroskobu gelişi ve floresan proteinlerin kullanımı, böylece hücre biyolojisi 1 anlayışımızı ilerleyen, akla gelebilecek her hücresel süreç üzerinde büyük atılımlar yol açmıştır. Bu alan deneysel manipülasyonlar konusunda özellikle son derece güçlü modeli sistemleri, memeli hücre kültürlerinin kullanılması büyük faydalar vardır. Ancak, genellikle karmaşık çok hücreli organizmaların 2 biyoloji gerçek temsilini vermemektedir. Bu sorun, nörobiyoloji, immünoloji ve tümör biyolojisi 3 gibi alanlarda önemli biyolojik soruları soruşturma için kapıyı açtı intravital mikroskobu (IVM) geliştirilmesi ele başlanmıştır. Şimdiye kadar, IVM göre çalışmaların çoğu hücre içi bölmelerin dinamikleri hakkında herhangi bir bilgi vermeden, doku ve tek tek hücrelerin düzeylerinde ifa edilmiştir. Son zamanlarda, laboratuvar ve diğers canlı kemirgenler 4-7, 13-15 ve in vivo olarak farmakolojik ve genetik manipülasyonlar izin görüntüleme hücre içi yapıların sahip IVM teknikleri geliştirmiştir. Bu yaklaşım, in vivo membran ticaretini incelemek için bizim tarafımızdan kullanılan ve daha spesifik endositoz ve ekzositoz olayları 6,7 düzenlenmiştir.
Bizim deneysel model sistem, teşhir stabilize ve anestezi kemirgenler submandibular tükürük bezleri (SGS) görüntüleme dayanmaktadır. IVM için bir model organı olarak SG-seçimi bezleri küçük bir ameliyat ile kolayca erişilebilir olması nedeniyle, kendi fizyolojisini ödün vermeden dışsallaştırılabileceği ve kalp atışı ve solunum nedeniyle hareket eserler azaltmak için stabilize edilebilir. Buna ek olarak, SGS seçici tükürük kanal 8,9 ile viral veya non-viral vektörlerin ya da bazlı püskürtülmesiyle genetik olarak manipüle edilebilir. Son olarak, SGS polarize epith oluşan salgı bezleri vardırasinüsü ve kanalları, miyoepitelial hücreler ve stromal hücrelerin karmaşık bir populasyonu oluşturmak Elial hücreleri. Bu nedenle, onlar bizim son çalışmalarda 10 vurgulandığı gibi, ekzositoz, endositoz, gen teslimi ve aktin iskeletinin çalışma, ve bu hücre polarite, hücre bölünmesi, hücre-hücre biyolojisi gibi yönlerini çalışma fırsatı sunmak için mükemmel bir model vardır hücre kavşaklar ve iyon kanalları.
Bu yazıda detaylı olarak canlı bir fare SG-epitelinde subselüler çözünürlük elde etmek için bir görüntüleme protokol açıklar. Özellikle, biz nasıl regüle ekzositoz sırasında SGS asiner hücrelerinde görüntü salgı granülleri göstermek. Daha önce gösterildiği gibi, beta-adrenerjik reseptör agonistleri ile uyarılması üzerine, salgı granüller apikal plazma membranı ile füzyon ve kademeli olarak daraltmak için asinar kanalcık 6 içine içeriklerini serbest bırakır. Amacımız m araştırmacılara temel araçları sağlamak içincerrahi prosedürler ve hayvan kullanımı konusunda inimal deneyim, başarılı bir hücrealtı çözünürlükte IVM gerçekleştirmek böylece. IVM de en zorlu kısmı hayvanın hazırlık olduğundan, burada biz onların işlevini ödün vermeden SGS ortaya çıkarmak ve hareketsiz için kullanılmaktadır temel cerrahi prosedürlerin açıklaması odaklanın. Sistemik floresan probları teslimi, transgenik hayvanların kullanılması ya da her ikisinin bir kombinasyonu gibi alt-hücresel yapılar, çeşitli stratejiler, etiketlemek için işlemler için olduğu gibi, başka bir yerde 7,11 tarif edilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Şimdiye kadar hücre içi yapılar daha çok in vitro (örneğin, hücre kültürleri,) ya da sık sık olduğu gibi canlı dokuların 6'nın özelliklerini özetlemek olmayan ex vivo (örneğin, organ kültürleri, doku dilimleri, asinar preparatlar) model sistemlerinde de görüntülenmiştir edilmiştir. Bu fareler yaşayan belirli bir membran kaçakçılığı adım (yani regüle ekzositoz) dinamiklerini görüntüleme sağlayan bu yana, bu anlamda, burada sunulan yaklaşı…
Acknowledgements
Bu araştırma NIH İntramural Araştırma Programı, Diş ve Kraniofasial Araştırmalar Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Reagent | |||
| Isoflourane (Forane) | Baxter | 101936-40 | Handle under chemical hood |
| Ketamine (ketaved) | Fort Dodge Animal Health | 57457-034-10 | Stock solution 100 mg/ml |
| Xylazine (Anased) | Akorn, Decatur | 61311-481-10 | Stock solution 100 mg/ml |
| Neomycin/Polymyxin B | Bausch and Lomb | 24208-785-55 | Use to lubricate the eye of the mouse |
| Carbomer-940 | Ashalnd, Inc. | 4607-1 | |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279 | Add drop wise to prevent the solution to solidify |
| Isoproternol | Sigma-Aldrich | 16504 | Prepare fresh solutions in saline when needed. Stocks can be stored at -20 °C |
| Instrument | |||
| Isoflurane V 1.9 (Vaporizer) | Braintree Scientific | 190AF | |
| Portable Downdraft table equipped with HEPA filter | Hazard Technology | PDDT | |
| Heat lamp, Model HL1 | Braintree Scientific | HL-1 US | |
| MicroTherma 2T Thermometer | Braintree Scientific | TW2 | |
| Operating Scissors (11.5 cm straight | World Precision Instruments | 5003708-12 | |
| #7 curved tip tweezers | World Precision Instruments | 14187 | |
| Microscissors | World Precision Instruments | 503365 | |
| Black Braided Silk suture #4.0 | George & Tiemann & Co | 160-1219-4 | |
| Gauze sponges 2″ x 2″ | Tyco Healthcare | 9022 | |
| Lens cleaning tissue | Olympus | CL-TISSUE (M97) AX6476 |
References
- Lippincott-Schwartz, J. Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*). Annu Rev Biochem. 80, 327-332 (2011).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
- Dunn, K. W., et al. Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 283, C905-C916 (2002).
- Masedunskas, A., Porat-Shliom, N., Weigert, R. Regulated exocytosis: novel insights from intravital microscopy. Traffic. 13, 627-634 (2012).
- Masedunskas, A., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13552-13557 (2011).
- Masedunskas, A., Weigert, R. Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents. Traffic. 9, 1801-1810 (2008).
- Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1347-C1357 (2009).
- Sramkova, M., Najman, S., et al. . Current Frontiers and Perspectives in Cell Biology. , (2012).
- Masedunskas, A., et al. Everything you need to know about intravital microscopy: A practical guide on imaging intracellular structures in live animals. Bioarchitecture. 2, (2012).
- Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., Weigert, R. Intravital microscopy to image membrane trafficking in live rats. Methods Mol. Biol. 931, 153-167 (2013).
- Babbey, C. M., Ryan, J. C., Gill, E. M., Ghabril, M. S., Burch, C. R., Paulman, A., Dunn, K. W. Quantitative intravital microscopy of hepatic transport. Intravital. 1, 44-53 (2012).
- Rothstein, E. C., Nauman, M., Chesnick, S., Balaban, R. S. Multi-photon excitation microscopy in intact animals. J. Microsc. 222, 58-64 (2006).
- Klinger, A., Orzekowsky-Schroeder, R., von Smolinski, D., Blessenohl, M., Schueth, A., Koop, N., Huettmann, G., Gebert, A. Complex morphology and functional dynamics of vital murine intestinal mucosa revealed by autofluorescence 2-photon microscopy. Histochem. Cell Biol. 137, 269-278 (2012).
- Peter, B., Van Waarde, M. A., Vissink, A., s-Gravenmade, E. J., Konings, A. W. Degranulation of rat salivary glands following treatment with receptor-selective agonists. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 22, 330-336 (1995).
