מיקרוסקופית Intravital למבני ההדמיה subcellular בעכברים חיים לבטא חלבוני פלורסנט
Summary
מיקרוסקופיה Intravital היא כלי רב עוצמה המאפשר הדמיה של תהליכים ביולוגיים שונים בבעלי חיים. במאמר זה, אנו מציגים שיטה מפורטת להדמית הדינמיקה של מבני subcellular, כגון גרגרי ההפרשה, בבלוטות הרוק של עכברים חיים.
Abstract
כאן אנו מתארים הליך למבני subcellular תמונה במכרסמים חיים המבוססים על השימוש במיקרוסקופ intravital confocal. כאיבר מודל, אנו משתמשים בבלוטות הרוק של עכברים חיים מכיוון שהם מספקים מספר יתרונות. ראשית, הם יכולים להיחשף בקלות כדי לאפשר גישה לאופטיקה, והתייצבו כדי להקל על ההפחתה של ממצא התנועה בשל פעימות לב ונשימה. זה מקל באופן משמעותי הדמיה ומעקב אחר מבני subcellular קטנים. שנית, רוב אוכלוסיות התאים של בלוטות הרוק נגישים מפני שטח של האיברים. זה מאפשר השימוש במיקרוסקופיה confocal שיש לו רזולוציה מרחבית גבוהה יותר מטכניקות אחרות שהיה בשימוש במשך in vivo הדמיה, כגון שני פוטונים במיקרוסקופ. לבסוף, ניתן להשפיע על בלוטות רוק בקלות פרמקולוגית וגנטי, ובכך לספק מערכת חזקה כדי לחקור תהליכים ביולוגיים ברמה מולקולרית.
במחקר זה אנו מתמקדים בפרוטוקול נועד לעקוב קינטיקה של exocytosis של גרגרי הפרשה בתאי acinar ואת הדינמיקה של קרום הפלזמה הפסגה שבו גרגרי הפרשת הפתיל על גירוי של קולטנים בטא adrenergic. באופן ספציפי, השתמשנו בעכבר מהונדס שישתף מבטא GFP cytosolic ופפטיד ממוקד קרום התמזגו עם חלבון טנדם-עגבניות ניאון. עם זאת, הנהלים ששמשנו לייצוב תמונה ובלוטות הרוק יכולים להיות מורחבים לדגמי עכבר אחרים ומצמידים את גישות אחרות לתווית רכיבים סלולריים in vivo, המאפשר ההדמיה של מבני subcellular שונים, כגון endosomes, lysosomes, מיטוכונדריה, ו שלד התא אקטין.
Introduction
בשני העשורים האחרונים כניסתו של מיקרוסקופיה חי והשימוש בחלבוני ניאון הובילו לפריצות דרך משמעותיות בכל תהליך סלולארי ניתן להעלות על הדעת, ובכך לקדם את ההבנה של ביולוגיה של תא 1 שלנו. תחום זה נהנה מאוד מהשימוש בתרביות תאים של יונקים שהן מערכות מודל חזקות מאוד, במיוחד כאשר מדובר במניפולציות ניסיוני. עם זאת, הם לא לעתים קרובים לספק ייצוג אמיתי של הביולוגיה של אורגניזמים רב תאיים מורכבים 2. בעיה זו החלה להיות מטופל על ידי הפיתוח של מיקרוסקופיה intravital (IVM) שפתחה את הדלת לבירורן של שאלות ביולוגיות מרכזיות בתחומים כמו נוירוביולוגיה, אימונולוגיה וגידול ביולוגיה 3. עד כה, רוב המחקרים המבוססים על IVM בוצעו ברמות של רקמות ותאים בודדים, מבלי לספק כל מידע על הדינמיקה של תאי subcellular. לאחרונה, המעבדה ואחרת שלנוים פיתחו טכניקות IVM מסוגלים מבני subcellular הדמיה במכרסמים חיים 4-7, 13-15 ומאפשרים מניפולציות תרופתי וגנטיות בגוף חי. גישה זו נוצלה בעבר על ידי לנו ללמוד סחר קרום in vivo, ובאופן ספציפי יותר אנדוציטוזה ומוסדרת exocytosis 6,7.
מערכת המודל הניסויית שלנו מבוססת על חשיפה, ייצוב והדמית בלוטות רוק submandibular (SGS) של מכרסמים בהרדמה. הבחירה של SGS כאיבר מודל לIVM היא בשל העובדה שהבלוטות נגישות בקלות על ידי ביצוע ניתוח קטן, יכול להיות מוחצן מבלי להתפשר על הפיסיולוגיה שלהם, והתייצב כדי להפחית את חפצי התנועה בשל פעימות לב ונשימה. בנוסף, SGS ניתן להשפיע באופן סלקטיבי מבחינה גנטית על ידי הזרקת וקטורים מבוססים או ויראלי או לא ויראלי דרך צינור רוק 8,9. לבסוף, SGS הם בלוטות אקסוקרינית מורכבות מepith המקוטבתאי elial, המהווים את acini והצינוריות, תאי myoepithelial, ואוכלוסייה מורכבת של תאי סטרומה. מסיבה זו, הם מודל מצוין ללמוד exocytosis, אנדוציטוזה, מסירת גן, ושלד תא אקטין, מודגש כמו במחקרים האחרונים שלנו 10, ומציע את ההזדמנות ללמוד היבטים של ביולוגיה של תא, כגון קוטביות תא, חלוקת תא, תא צמתים תא, ותעלות יונים.
במאמר זה אנו מתארים בפירוט פרוטוקול הדמיה להשגת הרזולוציה subcellular באפיתל של SGS של עכבר חי. באופן ספציפי, אנו מראים כיצד תמונת גרגרי ההפרשה בתאי acinar של SGS במהלך exocytosis המוסדר. כפי שניתן לראות בעבר, על גירוי עם אגוניסטים של הקולטן בטא adrenergic, גרגרי הפרשה להתמזג עם קרום הפלזמה הפסגה ויתמוטטו בהדרגה, משחררים את התוכן שלהם לcanaliculi acinar 6. המטרה שלנו היא לספק את הכלים הבסיסיים לחוקרים עם מ 'ניסיון inimal בפרוצדורות כירורגיות וטיפול בבעלי חיים, כך שהם יכולים לבצע בהצלחה IVM ברזולוציה subcellular. מאז החלק המאתגר ביותר בIVM הוא ההכנה של בעל החיים, כאן אנו מתמקדים בתיאור של פרוצדורות כירורגיות הבסיסיות שמנוצלות לחשוף ולשתק את SGS מבלי להתפשר על התפקוד שלהם. ובאשר לנהלים לתייג מבני subcellular, מספר אסטרטגיות, כגון משלוח מערכתי של בדיקות ניאון, שימוש בבעלי החיים מהונדסים, או שילוב של שניהם, כבר תאר במקום אחר 7,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
עד כה מבני subcellular כבר צילמו בעיקר במבחנה (תרביות תאים כלומר) או in vivo (כלומר איבר תרבויות, פרוסות רקמה, הכנות acinar) מערכות מודל לשעבר שלעתים קרובות אינו לשחזר את המאפיינים של רקמות גרו בשלמותה 6. מבחינה זו, הגישה המוצגת כאן מייצגת פריצת דרך משמעות?…
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי תכנית המחקר העירונית של NIH, המכון הלאומי למחקר דנטלי Craniofacial.
Materials
| Reagent | |||
| Isoflourane (Forane) | Baxter | 101936-40 | Handle under chemical hood |
| Ketamine (ketaved) | Fort Dodge Animal Health | 57457-034-10 | Stock solution 100 mg/ml |
| Xylazine (Anased) | Akorn, Decatur | 61311-481-10 | Stock solution 100 mg/ml |
| Neomycin/Polymyxin B | Bausch and Lomb | 24208-785-55 | Use to lubricate the eye of the mouse |
| Carbomer-940 | Ashalnd, Inc. | 4607-1 | |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279 | Add drop wise to prevent the solution to solidify |
| Isoproternol | Sigma-Aldrich | 16504 | Prepare fresh solutions in saline when needed. Stocks can be stored at -20 °C |
| Instrument | |||
| Isoflurane V 1.9 (Vaporizer) | Braintree Scientific | 190AF | |
| Portable Downdraft table equipped with HEPA filter | Hazard Technology | PDDT | |
| Heat lamp, Model HL1 | Braintree Scientific | HL-1 US | |
| MicroTherma 2T Thermometer | Braintree Scientific | TW2 | |
| Operating Scissors (11.5 cm straight | World Precision Instruments | 5003708-12 | |
| #7 curved tip tweezers | World Precision Instruments | 14187 | |
| Microscissors | World Precision Instruments | 503365 | |
| Black Braided Silk suture #4.0 | George & Tiemann & Co | 160-1219-4 | |
| Gauze sponges 2″ x 2″ | Tyco Healthcare | 9022 | |
| Lens cleaning tissue | Olympus | CL-TISSUE (M97) AX6476 |
References
- Lippincott-Schwartz, J. Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*). Annu Rev Biochem. 80, 327-332 (2011).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
- Dunn, K. W., et al. Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 283, C905-C916 (2002).
- Masedunskas, A., Porat-Shliom, N., Weigert, R. Regulated exocytosis: novel insights from intravital microscopy. Traffic. 13, 627-634 (2012).
- Masedunskas, A., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13552-13557 (2011).
- Masedunskas, A., Weigert, R. Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents. Traffic. 9, 1801-1810 (2008).
- Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1347-C1357 (2009).
- Sramkova, M., Najman, S., et al. . Current Frontiers and Perspectives in Cell Biology. , (2012).
- Masedunskas, A., et al. Everything you need to know about intravital microscopy: A practical guide on imaging intracellular structures in live animals. Bioarchitecture. 2, (2012).
- Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., Weigert, R. Intravital microscopy to image membrane trafficking in live rats. Methods Mol. Biol. 931, 153-167 (2013).
- Babbey, C. M., Ryan, J. C., Gill, E. M., Ghabril, M. S., Burch, C. R., Paulman, A., Dunn, K. W. Quantitative intravital microscopy of hepatic transport. Intravital. 1, 44-53 (2012).
- Rothstein, E. C., Nauman, M., Chesnick, S., Balaban, R. S. Multi-photon excitation microscopy in intact animals. J. Microsc. 222, 58-64 (2006).
- Klinger, A., Orzekowsky-Schroeder, R., von Smolinski, D., Blessenohl, M., Schueth, A., Koop, N., Huettmann, G., Gebert, A. Complex morphology and functional dynamics of vital murine intestinal mucosa revealed by autofluorescence 2-photon microscopy. Histochem. Cell Biol. 137, 269-278 (2012).
- Peter, B., Van Waarde, M. A., Vissink, A., s-Gravenmade, E. J., Konings, A. W. Degranulation of rat salivary glands following treatment with receptor-selective agonists. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 22, 330-336 (1995).
