Intravital mikroskopi af Imaging Subcellulære Strukturer Live mus, der udtrykker fluorescerende proteiner
Summary
Intravital mikroskopi er et kraftfuldt værktøj, der giver billeddannelse forskellige biologiske processer i levende dyr. I denne artikel præsenterer vi en detaljeret metode til billeddannelse dynamikken i subcellulære strukturer, såsom de sekretoriske granulat, i spytkirtlerne af levende mus.
Abstract
Her beskriver vi en procedure til billede subcellulære strukturer i levende gnavere, der er baseret på anvendelse af konfokal intravital mikroskopi. Som model organ, bruger vi spytkirtlerne af levende mus, da de giver flere fordele. For det første kan de let udsættes for at muliggøre adgang til optikken, og stabiliseres for at lette reduktionen af bevægelsesartefakter grund hjerteslag og respiration. Dette letter billedbehandling og spore små subcellulære strukturer betydeligt. For det andet er de fleste af cellepopulationer spytkirtlerne er tilgængelige fra overfladen af organet. Dette tillader anvendelse af konfokal mikroskopi, der har en højere rumlig opløsning end andre teknikker, der har været anvendt til in vivo-billeddannelse, såsom to-foton mikroskopi. Endelig kan spytkirtler nemt manipuleres farmakologisk og genetisk, hvilket giver et robust system til at undersøge biologiske processer på molekylært niveau.
I denne undersøgelse har vi fokus på en protokol til at følge kinetikken af exocytose af sekretoriske granula i acinære celler og dynamikken i den apikale plasmamembran, hvor de sekretoriske granula fusionerer ved stimulering af beta-adrenerge receptorer. Konkret har vi brugt en transgen mus, der co-udtrykker cytosol GFP og en membran målrettet peptid fusioneret med det fluorescerende protein tandem-Tomat. Dog kan de procedurer, som vi brugte til at stabilisere og image spytkirtlerne kan udvides til andre musemodeller og koblet til andre tilgange til at mærke in vivo cellulære komponenter, der muliggør visualisering af forskellige subcellulære strukturer, såsom endosomes, lysosomer, mitokondrier og actin cytoskeleton.
Introduction
I de seneste to årtier fremkomsten af levende mikroskopi og brug af fluorescerende proteiner har ført til store gennembrud på hver cellulær proces tænkelige, og dermed fremme vores forståelse af cellebiologi 1. Dette felt har nydt voldsomt fra anvendelsen af mammale cellekulturer, der er ekstremt stærke modelsystemer, især når det kommer til eksperimentelle manipulationer. Men de ofte ikke giver en korrekt gengivelse af biologi komplekse flercellede organismer 2. Dette spørgsmål er begyndt at blive behandlet af udviklingen af intravital mikroskopi (IVM), som har åbnet døren på at undersøge de vigtigste biologiske spørgsmål inden for områder som neurobiologi, immunologi og tumor biologi 3. Hidtil er de fleste af de undersøgelser, der er baseret på IVM er blevet udført på de niveauer, væv og de enkelte celler, uden at give nogen oplysninger om dynamikken i subcellulære afsnit. For nylig vores laboratorium og andres har udviklet IVM teknikker, der kan imaging subcellulære strukturer i levende gnavere 4-7, 13-15 og tillader farmakologiske og genetiske manipulationer in vivo. Denne fremgangsmåde er blevet brugt af os til at studere membran trafficking in vivo, og mere specifikt endocytose og reguleret exocytose 6,7.
Vores eksperimentelle model system er baseret på at afsløre, stabilisere og billeddannelse submandibulære spytkirtlerne (SGS) af bedøvede gnavere. Valget af strain gauges som en model organ for IVM skyldes det faktum, at kirtler er let tilgængelige ved at udføre en mindre operation kan externalized uden at kompromittere deres fysiologi, og stabiliseret for at reducere bevægelsesartefakter grund hjerteslag og respiration. Desuden kan strain gauges selektivt manipuleres genetisk ved injektion enten virale eller ikke-virale vektorer gennem spytudførselsgang 8,9. Endelig strain gauges er exokrine kirtler sammensat af polariseret epithelial celler, der danner acini og kanalerne, myoepitelcellerne og en kompleks population af stromaceller. Af denne grund, de er en glimrende model til at studere exocytose, endocytose, gen levering, og aktincytoskelet, som fremhævet i vores seneste undersøgelser 10, og tilbyder mulighed for at studere aspekter af cellebiologi, såsom celle polaritet, celledeling, celle- celle vejkryds og ionkanaler.
I dette papir, vi beskriver i detaljer, en imaging-protokol for at opnå subcellulære opløsning i epitel SGS med en levende mus. Konkret viser vi, hvordan billedet de sekretoriske granula i acinuscellerne af SGS under reguleret exocytose. Som tidligere vist, efter stimulering med agonister af beta-adrenerge receptor, sekretoriske granula fusionerer med den apikale plasmamembran og gradvist bryde sammen, frigiver deres indhold til acinære canaliculi 6. Vores mål er at give de grundlæggende værktøjer til efterforskerne med minimal erfaring i kirurgiske procedurer og håndtering af dyr, således at de med succes kan udføre IVM på en subcellulære opløsning. Da den mest udfordrende del i IVM er forberedelsen af dyret, her har vi fokus på beskrivelsen af de basale kirurgiske procedurer, der er brugt til at afsløre og immobilisere SGS uden at kompromittere deres funktion. Med hensyn til de procedurer, til at mærke subcellulære strukturer, flere strategier, såsom systemisk levering af fluorescerende prober, anvendelse af transgene dyr, eller en kombination af begge, er blevet beskrevet andetsteds 7,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hidtil subcellulære strukturer er blevet afbildet meste i in vitro (dvs. cellekulturer), eller i ex vivo (dvs. organisa-kulturer, vævssnit, acinare præparater) modelsystemer, ofte ikke rekapitulere karakteristika intakte levende væv 6. I denne henseende den strategi, der fremlægges her, er et stort gennembrud, da det giver billeddannelse dynamikken i trin et bestemt membran trafficking (dvs. reguleret exocytose) i levende mus.
Denne protokol udgør …
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af Intramural Research Program af NIH, National Institute of Dental og kraniofacial Research.
Materials
| Reagent | |||
| Isoflourane (Forane) | Baxter | 101936-40 | Handle under chemical hood |
| Ketamine (ketaved) | Fort Dodge Animal Health | 57457-034-10 | Stock solution 100 mg/ml |
| Xylazine (Anased) | Akorn, Decatur | 61311-481-10 | Stock solution 100 mg/ml |
| Neomycin/Polymyxin B | Bausch and Lomb | 24208-785-55 | Use to lubricate the eye of the mouse |
| Carbomer-940 | Ashalnd, Inc. | 4607-1 | |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279 | Add drop wise to prevent the solution to solidify |
| Isoproternol | Sigma-Aldrich | 16504 | Prepare fresh solutions in saline when needed. Stocks can be stored at -20 °C |
| Instrument | |||
| Isoflurane V 1.9 (Vaporizer) | Braintree Scientific | 190AF | |
| Portable Downdraft table equipped with HEPA filter | Hazard Technology | PDDT | |
| Heat lamp, Model HL1 | Braintree Scientific | HL-1 US | |
| MicroTherma 2T Thermometer | Braintree Scientific | TW2 | |
| Operating Scissors (11.5 cm straight | World Precision Instruments | 5003708-12 | |
| #7 curved tip tweezers | World Precision Instruments | 14187 | |
| Microscissors | World Precision Instruments | 503365 | |
| Black Braided Silk suture #4.0 | George & Tiemann & Co | 160-1219-4 | |
| Gauze sponges 2″ x 2″ | Tyco Healthcare | 9022 | |
| Lens cleaning tissue | Olympus | CL-TISSUE (M97) AX6476 |
References
- Lippincott-Schwartz, J. Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*). Annu Rev Biochem. 80, 327-332 (2011).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
- Dunn, K. W., et al. Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 283, C905-C916 (2002).
- Masedunskas, A., Porat-Shliom, N., Weigert, R. Regulated exocytosis: novel insights from intravital microscopy. Traffic. 13, 627-634 (2012).
- Masedunskas, A., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13552-13557 (2011).
- Masedunskas, A., Weigert, R. Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents. Traffic. 9, 1801-1810 (2008).
- Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1347-C1357 (2009).
- Sramkova, M., Najman, S., et al. . Current Frontiers and Perspectives in Cell Biology. , (2012).
- Masedunskas, A., et al. Everything you need to know about intravital microscopy: A practical guide on imaging intracellular structures in live animals. Bioarchitecture. 2, (2012).
- Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., Weigert, R. Intravital microscopy to image membrane trafficking in live rats. Methods Mol. Biol. 931, 153-167 (2013).
- Babbey, C. M., Ryan, J. C., Gill, E. M., Ghabril, M. S., Burch, C. R., Paulman, A., Dunn, K. W. Quantitative intravital microscopy of hepatic transport. Intravital. 1, 44-53 (2012).
- Rothstein, E. C., Nauman, M., Chesnick, S., Balaban, R. S. Multi-photon excitation microscopy in intact animals. J. Microsc. 222, 58-64 (2006).
- Klinger, A., Orzekowsky-Schroeder, R., von Smolinski, D., Blessenohl, M., Schueth, A., Koop, N., Huettmann, G., Gebert, A. Complex morphology and functional dynamics of vital murine intestinal mucosa revealed by autofluorescence 2-photon microscopy. Histochem. Cell Biol. 137, 269-278 (2012).
- Peter, B., Van Waarde, M. A., Vissink, A., s-Gravenmade, E. J., Konings, A. W. Degranulation of rat salivary glands following treatment with receptor-selective agonists. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 22, 330-336 (1995).
