Anormal Mitoz ile İlişkili Hücre Ölümü Canlı Kanser Hücreleri Konfokal Görüntüleme Uyacakları
Summary
Mitoz geçiren kanser hücrelerinde fenantridin PJ-34 sitotoksik aktivite canlı konfokal görüntüleme ile gerçek zamanlı olarak belgelenmiştir. PJ-34 eradike insan meme kanseri MDA-MB-231 mitoz İlave sentrozom barındıran hücreler. Normal iki odak mitoz farklı olarak, ekstra-sentrozom PJ-34 varlığında iki kutup mili kümelenmiş değildi.
Abstract
Güçlü PARP1 inhibitörleri olarak hareket fenantren türevleri mitoz çoklu-centrosomal insan kanser hücrelerinde Sürnümerer centrosomes en iki odak kümeleme engelledi. Fenantridin PJ-34 molekülü en güçlü idi. İlave sentrozom Declustering çoklu centrosomal hücrelerindeki mitotik yetmezliği ve hücre ölümüne neden olur. En katı insan kanser ekstra centrosomes yüksek olay var. PJ-34 aktivitesi canlı bir insan meme kanseri sentrozom oldukça bol olduğu floresan γ-tubulin kodlayan vektörler ve floresan histon H2b mevcut için transfekte edilmiş MDA-MB-231 hücrelerinin konfokal görüntüleme ile gerçek zamanlı olarak belgelenmiştir kromozomlar. Anormal kromozomlar düzenlemeler ve declustered centrosomes temsil eden de-kümelenmiş γ-tubulin odakları PJ-34 ile tedavi sonrası transfekte MDA-MB-231 hücrelerinde tespit edildi. Iki mil kutuplarda un-kümelenmiş ekstra centrosomes kendi hücre ölümü öncesinde. Bu sonuçlar, FO bağlantılıR, ilk kez İlave sentrozom mitoz de-kümeleme ve hücre ölümüne yol açan mitotik yetmezliği olan insan kanser hücreleri, PJ-34 arasında en son tespit edilen özel sitotoksik aktivitesi. Iki centrosomes ve iki odak iğ ile mitoz geçiren normal hücrelere zarar vermeden sabit hücreler, çok centrosomes ile PJ-34 özel ortadan kanser hücrelerinin konfokal görüntüleme tarafından gözlemlenen önceki bulgulara göre. PJ-34 Bu sitotoksik aktivite diğer güçlü PARP1 inhibitörleri tarafından paylaşılan değildi ve PARP1 inhibisyon bağımsızlığını düşündüren, PARP1 eksik MEF barındıran extracentrosomes gözlendi. Konfokal görüntüleme Canlı mitoz sırasında hücrelerin ortadan kaldırılması yeni moleküller belirlenmesi için yararlı bir araç sundu.
Introduction
Fenantren, PJ-34 de dahil olmak üzere PARP1 inhibitörleri, elde edilen stres koşulları (inme ya da miyokard infarktüsü) 1 altında enerji tüketen PARP1 aracılı DNA-onarım ile oluşturulan apoptotik hücre ölüm pasif hücreleri korumak için tasarlanmıştır. Ancak, son zamanlarda biz PJ-34, bu uyaran PARP1 inhibe göre iki kat daha yüksek konsantrasyonda, sadece insan kanser hücrelerinin 2,3 hücre ölümüne neden olabilir keşfetti. Hücrenin daha hızlı yayılması olduğu, hücrelerin daha verimli ortadan kaldırılması oldu. PJ-34 sitotoksik aktivite ekstra centrosomes mitoz 2 de-kümeleme bağlandı. Birçok insan kanser hücreleri liman 4,5 multicentrosomes. Etkili bir mitoz iki sentrozom barındıran hareketsiz hücreler ya da iyi huylu proliferatif hücrelerin zarar vermeden 72-96 saat içinde, bu hücrelerin ortadan 20 uM PJ-34 ile supernümere sentrozom liman insan meme kanseri hücreleri, MDA-MB-231, inkübasyonu <sup> 2,3. İyi huylu hücrelerin insan timus hazırlanan MCF-10, insan meme epitelyal hücreleri, insan endotelyal hücreleri (HUVEC) ve primer mezenkimal hücreler dahildir. Bu hücreler, PJ-34 sitotoksik aktivitesi dirençli bulunmuştur. PJ-34 96 saat inkübasyon sırasında kendi cep döngüsü müdahale ya da centrosomes ve iki odak milli oluşumu 2,3 etkilemedi.
Bipolar centrosome montaj mitoz 4,5 bipolar mili oluşumu için çok önemlidir. Bu nedenle, ikiden fazla centrosomes ile hücre iki kutup 4-9 kendi ekstra centrosomes kümeleme, bir güçlükle anlaşılan moleküler mekanizması geliştirdik. Kendi centrosomes bipolar montaj hatası tutuklamalar G2 / M tutuklama hücre döngüsü ve hücre ölümüne yol açan 4,5 mitotik başarısızlığı bu çok kutuplu bozuk iğ ve anormal kromozomlar ayrışmaya neden olabilir. Ekstra centrosomes de-kümeleme altında yatan moleküler mekanizmalar yoğun incelenmiştir <> 10 destek. Sağlıklı dokuları 5,10 korurken bu ölüm mekanizması anlamak kanser hücrelerinin özel ortadan kaldırılması sağlayacaktır.
Bu nedenle, mitotik felaket hücre ölümü geçiren bileşiklerin konfokal görüntüleme İlave sentrozom kümeleme etkileyen molekülleri tanımlamak için kullanılabileceğini göstermektedir, insan katı cancers.Our sonuç geniş etkili olabileceği seçici bir kanser tedavisinde yeni bir mod, teklif mitoz 2,3, ilaç adayları hedef bu bileşiklerin kanser render.
Biz sabit ve canlı insan kanser hücreleri (mitoz ekstra-centrosomes yüksek çıkması ile) karşı normal hücreler tarayarak fenantridin PJ-34 sitotoksik aktivite belgeledi. Bir adım insan kanser hücrelerinde PJ-34 sitotoksik aktivitesini tanımlamak için kullanılan görüntüleme yöntemleri adım açıklama aşağıda yer almaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Konfokal görüntüleme mitoz sırasında canlı çok centrosomal hücreleri (Şekil 3 ve Ek bilgileri) PJ-34 sitotoksik etkisinin gerçek zamanlı belgeler temin yaşıyor. Bu PJ-34 5-9 Mitotik Afet hücre ölümünün indüksiyon düşündüren, ekstra centrosomes de-kümeleme ve hücre ölümüne insan kanser hücrelerinde PJ-34 sitotoksisite atfederek ilk canlı belgelerine oldu. Bunun aksine, süper numerary sentrozom iki odak kümeleme iki focali kümelenmiş ilave sentrozom (Ş…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırmanın finansman kaynakları: Tel Aviv Üniversitesi teknoloji transferi şirketi, Ramot ve Sheba-Tıp Merkezi (M. CA ve SI.), ICRF ortak bir fon – İsrail Kanser Araştırma Vakfı (M. CA.) Ve İsrail bilim Vakfı ( SI).
Materials
| REAGENTS | |||
| DMEM | Invitrogen (GIBCO) | 41965 | |
| FBS (Fetal bovine Serum) | Invitrogen (GIBCO) | 12657 | |
| Pen-Strep-Ampho solution | Biological Industries, Israel | 03-033-1B | |
| L-glutamine | Invitrogen (GIBCO) | 25030-024 | |
| 0.25% Tripsin-EDTA | Invitrogen (GIBCO) | 25200 | |
| 92 mm Petri dishes | Nunc,Thermo scientific | 150350 | |
| 35 mm poly-D-lysine coated glass bottom culture dishes | MatTek Corporation, USA | P35GC-0-14-C | |
| Luminescent ATP detection assay kit | Abcam | ab113849 | |
| NDS (Normal Donkey Serum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Anti α-tubulin antibody | Sigma | T9026 | 1:250 dilution (IF) |
| Anti γ-tubulin antibody | Sigma | T5192 | 1:200 dilution (IF) |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11017 | 1:1,000 dilution (IF) |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | A-10042 | 1:1,000 dilution (IF) |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI (mounting) | Invitrogen | P36935 | |
| JetPEI (liposomal transfection reagent ) | Polyplus | 101-10 | |
| EQUIPMENT | |||
| Confocal microscope | Leica (Mannheim, Germany) | TCS SP5II |
References
- Jagtap, P., et al. Novel phananthridine inhibitors of poly(adenosine 5′-diphosphate-ribose) synthetase: Potent cytoprotective and antishock agents. Crit. Care Med. 30, 1071-1082 (2002).
- Castiel, A., et al. A small molecule exclusively eradicates human cancer cells: Extra-centrosomes de-clustering agent. BMC Cancer. 11 (1), 412 (2011).
- Inbar-Rozensal, D., et al. A selective eradication of human nonhereditary breast cancer cells by phenanthridine -derived polyADP-ribose polymerase inhibitors. Breast Cancer Res. 11 (6), R78 (2009).
- Gergely, F., Basto, R. Multiple centrosomes: together they stand, divided they fall. Genes Dev. 22, 2291-2296 (2008).
- Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Canc. Met. Rev. 28, 85-98 (2009).
- Doxsey, S. Re-evaluating centrosome function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 688-698 (2001).
- Walczak, C. E., Heald, R. Mechanisms of mitotic spindle assembly and function. International Rev. of Cytology. 265, 111-158 (2008).
- Ogden, A., Rida, P. C. G., Aneja, R. Let’s huddle to prevent a muddle: centrosome declustering as an attractive anticancer strategy. Cell Death Differ. 19, 1255-1267 (2012).
- Kramer, A., Anderhub, S., Maier, B., Schatten, E. Mechanisms and Consequences of centrosomes clustering in cancer cells. The Centrosome: Cell and Molecular mechanisms of functions and disfunctions in disease. , 255-277 (2012).
- Galimberti, F., et al. Anaphase Catastrophe Is a Target for Cancer Therapy. Clin. Cancer Res. 17, 1218-1222 (2011).
- Kanai, M., et al. Haploinsufficiency of poly(ADP-ribose) polymerase-1-mediated poly(ADP-ribosyl)ation for centrosome duplication. Biochem. Biophys. Res. Commun. 359, 426-430 (2007).
- Gartner, E. M., Burger, A. M., Lorusso, P. M. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors: a novel drug class with a promising future. Cancer J. 16, 83-90 (2010).
- Wahlberg, E., et al. Family-wide chemical profiling and structural analysis of PARP and tankyrase inhibitors. Nature Biotechnology. 30, 283-288 (2012).
- Rouleau, M., Patel, A., Hendze, M. J., Kaufmann, S. H., Poirier, G. G. PARP inhibition: PARP1 and beyond. Nature Rev. Cancer. 10, 293-301 (2010).
- Leber, B., et al. Proteins Required for Centrosome Clustering in Cancer Cells. Sci. Transl. Med. 2 (33), 33-38 (2010).
- Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar division in cancer cells with extra centrosomes. Gene Dev. 22, 2189-2203 (2008).
