Renal Capsule Xenografting og subkutane Pellet Implantation for Vurdering af prostata Carcinogenesis og benign prostatahyperplasi
Summary
Vi beskriver fremstillingen af komprimerede hormon pellets samt subkutan kirurgisk implantation i mus. Denne strategi kan kombineres med væksten af celler og væv xenotransplantater under nyrekapslen af athymiske nøgne mus for at evaluere hormonal carcinogenese og regulering af benign prostata vækst.
Abstract
Nye behandlingsmetoder til to almindelige prostata sygdomme, prostatakræft (PRCA) og benign prostatahyperplasi (BPH), afhænger kritisk på eksperimenter evaluering deres hormonelle regulering. Sex steroidhormoner (især androgener og østrogener) er vigtige i PRCA og BPH, vi sonde deres respektive roller i at tilskynde prostata vækst og carcinogenese i mus med eksperimenter ved hjælp af komprimerede hormon piller. Hormon-og / eller narkotika pellets let fremstillet med en pillepresse og kirurgisk implanteres i det subkutane væv i hanmus vært. Vi beskriver også en protokol til evaluering af hormonal carcinogenese ved at kombinere subkutan hormon pille implantation med xenografting af prostatacellelinjer rekombinanter under nyrekapslen af immunsvækkede mus. Desuden subkutan hormon pellet implantation, i kombination med nyrekapsel xenografting BPH væv, er nyttig for bedre at forstå hormonelle regulering af benign prostspiste vækst, og for at afprøve nye behandlingsformer rettet mod sex steroid hormon veje.
Introduction
Prostatakræft (PRCA) og benign prostatahyperplasi (BPH) er betydelige sundhedsmæssige byrder. PRCA er den anden mest udbredte solid organ kræft hos mænd og en førende årsag til kræft dødsfald 1. BPH er også meget udbredt blandt ældre mænd, og det skønnes, at den kliniske manifestation af BPH, nedre urinveje (LUTS), vil påvirke 50-90% af mændene 2. Mens androgener og østrogener er kendt for at være vigtige i PRCA og BPH, vores forståelse af de hormonelle mekanismer, der ligger til grund karcinogenese og vækst stadig ufuldstændig 3,4. Enkel og genetisk medgørlige dyremodeller understøtter de undersøgelser, der vil tage fat disse prioriteringer i prostata forskning. I hormon responsive sygdomme såsom PRCA og BPH, anvendelse af subkutan, langsom frigivelse hormon pellets, alene eller i kombination med nyrekapsel xenografting (overførsel af celler, væv eller organer fra én art til en anden) i immunocompromised mus vært, giver en enkel og reproducerbar metode til at studere hormonel regulering af vækst og carcinogenese.
Subkutan hormon pellet implantation er en enkel og reproducerbar metode til at studere hormonale regulering af carcinogenese og godartet vækst i prostata 5. Subkutan implantation af voksne hanmus med 25 mg testosteron (T) og 2,5 mg 17β-østradiol (E2), medfører en stigning i serum E 2 og gradvise fald i T, genskabe dynamisk hormonelle miljø aldrende mænd 5,6. Desuden denne model sammenfatter mange af de kliniske træk ved BPH-LUTS 5,7. Alternative metoder til hormon administration omfatter oral / tvangsfodring eller intraperitoneal injektion, som forårsager lidelse for den gnaver, er mindre konsekvent i at levere den samme mængde stof over tid, og er mere arbejdskrævende end en engangs-kirurgisk implantation. Andre subkutane tilstande for hormone og / eller drug delivery omfatter silastikkapsler 8. Mens vi har også erfaring med brug af silastikkapsler, er komprimeret pellets foretrukket for deres brugervenlighed og reproducerbarhed. Desuden frigivelse satser komprimerede hormon piller bedre efterligne de dynamiske sex steroid hormon nøgletal observeret i aldrende mænd 5,7.
Da udviklingen af genetisk immunkompromitterede mus har adskillige in vivo modelsystemer inkorporerer xenografting teknikker blevet udviklet til undersøgelse af en lang række normale og sygdomsramte væv. Der er flere grundlæggende kategorier af xenografting. Tissue xenotransplantater består af et lille stykke af intakt væv, som kan være en normal struktur, malign tumor eller godartet vækst. Szot et al. (2007) har for nylig belyst nyrekapsel xenografting af pancreasøer 9. Aamdal et al. (1985) beskrevet nyrekapsel xenografting af 27 menneskelige kræftceller i immunocompromised mus er vært for 10. Transplantater kan også være sammensat af en enkelt immortaliseret cellelinie (kræft eller ikke-tumorigene) eller kan bestå af en udødeliggjort cellelinie kombineret med celler isoleret fra mesenkym (celle rekombinant graft).
Vi går ind xenografting af celle rekombinanter at sonden respektive roller stroma og epithel i udviklingen af PRCA og BPH. Cunha et al. (1980) var den første til at rapportere, at når voksne murine blære epitel er kombineret med embryonale urogenital sinus mesenchym (UGM) og xenotransplanteret under nyrekapslen af hanmus værter, vævet udvikler sig til strukturer, der ligner prostata acini 11. Norman et al. (1986) viste, at voksne mus prostata duktalt epitel og UGM, når de kombineres i væv rekombinanter, gennemgå duktalt vækst og forgrening morfogenese 12. Hayward et al. (1988) viste, at human prostata epithel reagerer på induktiv føtal mesenchyme på lignende måde 13. En hormonal model af carcinogenese i prostata ved at kombinere immortaliseret human prostata epitelcellelinie BPH 1 med UGM blev først rapporteret af 14 Wang et al. (2001) og har været anvendt i udstrakt grad i vores laboratorium 15. Denne model er velegnet til at forstå PRCA progression fordi benign prostata epitel forvandler til metastatisk sygdom, modellering fremskreden PRCA hos mennesker 5. Fordi specifikke komponenter kan være genetisk manipuleret, celle rekombinant podning er især nyttig som en tilgang til at evaluere stroma-epitelial interaktioner.
Andre steder er egnede til xenografting er intradermal, subkutan og ortotopisk placeringer 16. Afhængigt af vævet og sygdomsprocessen af interesse, kan disse være egnede alternative tilgange. Til undersøgelse af prostata hormonal carcinogenese og godartet vækstregulering, vælger vi nyrekapslensite for xenografting på grund af sin højere graft tage sats, rigelige blodforsyning, og evne til at implantere et større antal implanteret i en begrænset sted 16.. Desuden hormonmanipulation af værtens mus, der resulterer i atrofi af prostata begrænser brugen af prostata orthotopisk transplantation 16.
Denne protokol beskriver teknikker komprimeret hormon / lægemiddel pellet fremstilling og kirurgisk implantation samt nyrekapsel xenografting af human prostata celle-og vævstransplantater. Sammen disse teknikker giver et følsomt assay til bestemmelse af, om en genetisk modificeret mus er mere modtagelige for PRCA og / eller BPH initiering end kontrol stammer. Xenografting er en kraftfuld teknik til in vivo evaluering af potentialet af eksperimentelle celler til at udvikle histologiske og molekylære egenskaber af malignitet, samt et assay for nye behandlingsstrategier til en bred vifte af godartede og ondartede sygdomme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette papir og protokollen beskrevet heri beskriver fremstillingen af komprimerede hormon og / eller narkotika-pellets og den kirurgiske procedure til subkutan pellet implantation af mus. Afhængig af forskning spørgsmål, der skal behandles, kan denne teknik udføres enkeltvis eller i kombination med nedsat kapsel xenografting af prostata celle rekombinante podninger eller prostata væv implanteret, som er teknikker almindeligt anvendt i prostata forskning 17-19. Tilsammen disse teknikker tilbyder en …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke alle medlemmer af Ricke lab, fortid og nutid. Vi takker Calvin Patten, Jr., DVM og Brigitte Raabe, DVM, for nyttige kommentarer til protokollen. Vi vil gerne anerkende den NIDDK, NCI, og NIEHS for deres økonomiske støtte til disse undersøgelser: R01DK093690, R01CA123199, RC2ESO18764. TMN er en praktikant i Medical Scientist Training Program ved University of Rochester finansieret af NIH T32 GM07356, NIH under Ruth L. Kirschstein National Research Service Award F30DK093173 understøtter også dette projekt. CDV understøttes af T32CA157322 og ABT understøttes af T32ES007015 ved University of Wisconsin-Madison. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Institute of General Medical Sciences eller NIH.
Materials
| EQUIPMENT & MATERIALS | |||
| Pellet press | PARR Industries | 2815 | 3mm Punch & Die set |
| Analytical Balance | Ohaus | 1918302 | Voyager or other |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 03-962Q | |
| Dissecting microscope | Leica | L2 | |
| Deltaphase Pad Kit (reheatable wax) | Braintree Scientific | 39DP | Alternative to an electric heating pad |
| Hot Bead sterilizer | F.S.T. | 18000-45 | |
| Isoflurane Vaporizer | Supera Anesthesia Innov | VAP3000 | |
| Induction Chamber | Supera Anesthesia Innov | RES644 | |
| F/AIR Canister | Supera Anesthesia Innov | 80120 | |
| 4 port Manifold | Supera Anesthesia Innov | RES536 | |
| Rebreathing Circuits | Supera Anesthesia Innov | CIR529 | |
| Inlet/Outlet Fittings | Supera Anesthesia Innov | VAP203/4 | |
| Pressure Reg/Gauge | Supera Anesthesia Innov | OXY508 | |
| Oxygen Flowmeter | Supera Anesthesia Innov | OXY660 | |
| 21mm Clear Tubing | Supera Anesthesia Innov | 301-150 | |
| Small Mice Nose Cone | Supera Anesthesia Innov | ACC526 | |
| Sterile surgical gown | Midwest Vet Supply | 350.79866.2 | |
| Surgical mask | Midwest Vet Supply | 350.50111.2 | 2-ply w/ earloops |
| Sterile gauze | Midwest Vet Supply | 001.14100.2 | 2 x 2 inches |
| Sterile Gloves | Kimberly Clark | 55092 | |
| Bouffant | Midwest Vet Supply | 001.27100.2 | |
| Cotton Tip Applicator | Midwest Vet Supply | 001.06220.2 | |
| Surgical Scrub Wash | Midwest Vet Supply | 733.80010.3 | |
| Sterile Fields (Fenestrated) | General Econopak, Inc | 88VCSTF | |
| REAGENTS | |||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C-3292 | |
| Testosterone Proprionate | Sigma-Aldrich | T-1875 | |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E-2758 | |
| Isoflurane | Midwest Vet Supply | 193.33161.3 | |
| Carprofen | Midwest Vet Supply | 193.70200.3 | Injectable (Rimadyl) |
| Betadine | Webster Veterinary | 07-836-3379 | |
| Sterile saline | Midwest Vet Supply | 193.74504.3 | NaCl 0.9%, Injectable |
| SURGICAL INSTRUMENTS | |||
| Straight Sharp/Blunt Scissors | Fine Scientific Tools (F.S.T.) | 14054-13 | |
| Graefe forceps (Serrated, Toothed, Curved) | F.S.T. | 11055-10 | |
| Fine Iris scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Graefe Scalpel | F.S.T. | 10071-12 | |
| Dumont #5 forceps | F.S.T. | 11251-20 | |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | S67050 | 5″ length |
| Graefe forceps (Serrated, Curved) | F.S.T. | 11052-10 | |
| Graefe forceps (Serrated, Straight) | F.S.T. | 11050-10 | |
| Vicryl Suture | Midwest Vet Supply | 295-92100.2 | 4-0, FS-2, Absorbable |
| Needle Holder w/ scissor action | F.S.T. | 12002012 | |
| Wound Clips | Braintree Scientific | ACS CS | May use 7mm or 9mm clips |
| Reflex Wound Clipper | F.S.T. | 12031-09 | Correspond w/ wound clip size |
| Would Clip Remover | F.S.T. | 12033-00 | Universal |
| Sterilization Container | F.S.T. | 20810-01 | Any autoclavable container will do |
| Syringe w/ needle | BD | 148292C | 1cc, 25Gx1 |
| Ear Tag Applicator | National Band & Tag Co. | 1005s1 | Alternative to ear notching |
| Small Animal Ear Tags | National Band & Tag Co. | 1005-1 |
References
- . . Cancer Facts Figures. 4, (2010).
- McVary, K. T. BPH: epidemiology and comorbidities. Am. J. Manag. Care. 12, S122-S128 (2006).
- Nicholson, T. M., Ricke, W. A. Androgens and estrogens in benign prostatic hyperplasia: past, present and future. Differentiation. 82, 184-199 (2011).
- Ricke, W. A., Wang, Y., Cunha, G. R. Steroid hormones and carcinogenesis of the prostate: the role of estrogens. Differentiation. 75, 871-882 (2007).
- Ricke, W. A., et al. Steroid hormones stimulate human prostate cancer progression and metastasis. Int. J. Cancer. 118, 2123-2131 (2006).
- Belanger, A., et al. Changes in serum concentrations of conjugated and unconjugated steroids in 40- to 80-year-old men. J. Clin. Endocrinol. 79, 1086-1090 (1994).
- Nicholson, T. M., et al. Testosterone and 17beta-estradiol induce glandular prostatic growth, bladder outlet obstruction, and voiding dysfunction in male mice. Endocrinology. 153, 5556-5565 (2012).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. J. Vis. Exp. (64), e4013 (2012).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice. J. Vis. Exp. (9), e404 (2007).
- Aamdal, S., Fodstad, O., Nesland, J. M., Pihl, A. Characteristics of human tumour xenografts transplanted under the renal capsule of immunocompetent mice. Brit. J. Cancer. 51, 347-356 (1985).
- Cunha, G. R., Lung, B., Reese, B. Glandular epithelial induction by embryonic mesenchyme in adult bladder epithelium of BALB/c mice. Investigative urology. 17, 302-304 (1980).
- Norman, J. T., Cunha, G. R., Sugimura, Y. The induction of new ductal growth in adult prostatic epithelium in response to an embryonic prostatic inductor. The Prostate. 8, 209-220 (1986).
- Hayward, S. W., et al. Interactions between adult human prostatic epithelium and rat urogenital sinus mesenchyme in a tissue recombination model. Differentiation. 63, 131-140 (1998).
- Wang, Y., et al. A human prostatic epithelial model of hormonal carcinogenesis. Cancer Res. 61, 6064-6072 (2001).
- Ricke, E. A., et al. Androgen hormone action in prostatic carcinogenesis: stromal androgen receptors mediate prostate cancer progression, malignant transformation and metastasis. Carcinogenesis. 33, 1391-1398 (2012).
- Wang, Y., et al. Development and characterization of efficient xenograft models for benign and malignant human prostate tissue. The Prostate. 64, 149-159 (2005).
- Goto, K., et al. Proximal prostatic stem cells are programmed to regenerate a proximal-distal ductal axis. Stem Cells. 24, 1859-1868 (2006).
- Xin, L., Ide, H., Kim, Y., Dubey, P., Witte, O. N. In vivo regeneration of murine prostate from dissociated cell populations of postnatal epithelia and urogenital sinus mesenchyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11896-11903 (2003).
- Priolo, C., et al. Establishment and genomic characterization of mouse xenografts of human primary prostate tumors. Am. J. Pathol. 176, 1901-1913 (2010).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586 (2011).
