כליות קפסולת Xenografting ותת עור מכבישי השרשה להערכת הערמונית Carcinogenesis והיפרפלזיה שפירה של הערמונית
Summary
אנו מתארים את הייצור של הורמון כדורים דחוסים, כמו גם השתלה כירורגית תת עורית לעכברים. אסטרטגיה זו יכולה להיות משולבת עם הצמיחה של xenografts תא והרקמה תחת הקפסולה הכליות של עכברים בעירום athymic להעריך היווצרות סרטן ורגולציה של צמיחת ערמונית שפירה הורמונלי.
Abstract
טיפולים חדשים עבור שתי מחלות נפוצות בבלוטת ערמונית, סרטן הערמונית (PrCa) והיפרפלזיה שפירה של הערמונית (BPH), תלויים באופן קריטי על ניסויי הערכת הוויסות הורמונלי שלהם. הורמוני סטרואידי מין (בעיקר אנדרוגנים ואסטרוגנים) הם חשובים בPrCa וBPH; לחקור התפקידים שלהם בזירוז צמיחת ערמונית וסרטן בעכברים עם ניסויים באמצעות כדורי הורמון דחוסים. כדורי הורמון ו / או תרופה מיוצרים בקלות עם עיתונות גלולה, וניתוח מושתלים לתוך הרקמה תת עורית של מארח עכבר הזכר. גם אנו מתארים פרוטוקול להערכת הסרטן הורמונלי על ידי שילוב של השתלת גלולה הורמון תת עורית עם xenografting של recombinants תא ערמונית תחת הקפסולה הכליות של עכברי מדוכאי חיסון. יתר על כן, השתלת גלולה הורמון תת עורי, בשילוב עם xenografting הקפסולה הכליות של רקמת BPH, כדאי להבין ויסות הורמונלי של פרוסט השפיר טוב יותראכלתי צמיחה, וכדי לבחון טיפולים חדשים מיקוד מסלולי הורמון מין סטרואידים.
Introduction
סרטן הערמונית (PrCa) והיפרפלזיה שפירה של הערמונית (BPH) הן מעמסה בריאותית משמעותית. PrCa הוא הסרטן השני הנפוץ ביותר מוצק האיבר אצל גברים וגורם מוביל לסרטן הקשורים למוות 1. BPH הוא גם נפוץ מאוד בקרב גברים מבוגרים, והערכה הוא כי הביטוי הקליני של BPH, תסמינים בדרכי שתן תחתון (LUTS), ישפיע 50-90% מהגברים 2. בעוד אנדרוגנים ואסטרוגנים ידועים להיות חשוב בPrCa וBPH, ההבנה של מנגנונים הורמונליים העומדים בבסיס היווצרות סרטן וצמיחה שלנו נשארה שלמה 3,4. מודלים של בעלי חיים פשוטים וגנטי צייתנים לחזק את המחקרים שיעסקו בסדרי עדיפויות אלה במחקר ערמונית. במחלות הורמון מגיבות כמו PrCa וBPH, השימוש בתת עור, כדורי הורמון שחרור איטיים, בבידוד או בשילוב עם xenografting הקפסולה הכליות (ההעברה של תאים, רקמות או איברים ממין אחד למשנו) לimmunocompמארח עכבר romised, מספק שיטה פשוטה לשחזור ללימוד רגולציה הורמונלית של צמיחה והיווצרות סרטן.
השתלת גלולה הורמון תת עורי היא טכניקה פשוטה ולשעתק ללמוד ויסות הורמונלי של סרטן וגידול שפיר בערמונית 5. השתלה תת עורית של עכברי זכרים מבוגרים עם 25 טסטוסטרון מ"ג (T) ו17β-אסטרדיול 2.5 מ"ג (ה 2), גורמת לעלייה בסרום E 2 וירידה הדרגתית בT, יצירה מחדש של הסביבה ההורמונלית הדינמית של גברים מזדקנים 5,6. בנוסף, מודל זה משחזר רבים של המאפיינים הקליניים של 5,7 BPH-LUTS. שיטות חלופיות של ממשל הורמון כוללות אוראלי / gavage או זריקת intraperitoneal, אשר גורם למצוקה למכרסמים, הם פחות עקביים באספקת אותה הכמות של תרופה לאורך זמן, ויותר עתיר עבודה מאשר השתלה כירורגית חד פעמית. מצבים תת עורית אחרים לשעותormone ו / או אספקת סמים כוללות כמוסות Silastic 8. אמנם יש לנו גם ניסיון עם שימוש בכמוסות Silastic, כדורים דחוסים הם העדיפו עבור קלות שימוש שלהם ושחזור. יתר על כן, שיעורי שחרורו של כדורי הורמון דחוסים יותר טובים לחקות את היחסים הדינמיים מין סטרואידי ההורמון נצפו בגברים מזדקנים 5,7.
מאז הפיתוח של עכברים גנטי חיסון, in vivo מערכות מודל רבים המשלבות טכניקות xenografting פותחו עבור המחקר של מגוון רחב של רקמות בריאות וחולות. ישנן מספר קטגוריות בסיסיות של xenografting. xenografts הרקמה מורכבת של פיסה קטנה של רקמה שלמה, אשר יכול להיות מבנה נורמלי, גידול ממאיר, או גידול שפיר. Szot et al. (2007) לאחרונה מואר xenografting הקפסולה כליות של איי לבלב 9. Aamdal et al. (1985) תאר xenografting הקפסולה כליות של 27 שורות תאי סרטן אנושיים בimעכבר munocompromised מארח 10. יכולים גם להיות מורכבים תלים של שורה אחת הנציחה תא (סרטנית או שאינה סרטנית), או יכולים להיות מורכב משורת תאים הונצחו בשילוב עם תאים מבודדים מmesenchyme (שתל רקומביננטי תא).
אנו דוגלים xenografting של recombinants תא כדי לבחון את תפקידיהם של stroma והאפיתל בפיתוח PrCa וBPH. Cunha et al. (1980) היה הראשון לדווח כי כאשר אפיתל שלפוחית העכברי מבוגר בשילוב עם mesenchyme עוברי ואברי המין סינוס (UGM) וxenografted תחת הקפסולה הכליות של מארחים עכברי זכרים, הרקמה מתפתחת למבנים הדומים acini ערמונית 11. נורמן et al. (1986) הראה כי אפיתל עכבר הבוגר של הערמונית ductal וUGM, כאשר הוא משולב בrecombinants רקמות, עוברים צמיחת ductal והסתעפות המורפוגנזה 12. הייוורד et al. (1988) הראה כי אפיתל ערמונית אדם מגיב לאינדוקטיביים מ 'עובריesenchyme באופן דומה 13. מודל ההורמונלית של הסרטן בערמונית, על ידי שילוב של שורת תאי אפיתל הונצח ערמונית אדם BPH-1 עם UGM, דווח לראשונה על ידי וואנג et al. 14 (2001) ונעשה שימוש נרחב במעבדה שלנו 15. מודל זה גם מתאים להבנת התקדמות PrCa כי אפיתל השפיר של הערמונית הופך למחלה גרורתית, דוגמנות PrCa המתקדמת בבני האדם 5. מכיוון שניתן להשפיע על רכיבים ספציפיים גנטי, השתלת רקומביננטי תא שימושית במיוחד כגישה להעריך אינטראקציות סטרומה-אפיתל.
אתרים אחרים המתאימים לxenografting הם intradermal, תת עורית ובמקומות orthotopic 16. בהתאם לתהליך הרקמות ומחלות של עניין, אלה עשויים להיות גישות חלופיות מתאימות. לצורך המחקר של סרטן ערמונית הורמונליים ורגולציה גידול שפירה, אנו בוחרים את הקפסולה הכליותאתר לxenografting בשל השתל גבוה יותר שלה לקחת שיעור, אספקת דם בשפע, ויכולת להשתיל מספר רב יותר של xenografts לאתר מוגבל אחד 16. יתר על כן, מניפולציה הורמונלית של עכבר המארח כי תוצאות בניוון של הערמונית מגבילה את השימוש בהשתלת orthotopic ערמונית 16.
פרוטוקול זה מתאר טכניקות של ייצור הורמון דחוס / סמים גלולה והשתלה כירורגית, כמו גם xenografting הקפסולה כליות של שתלי תא ערמונית אנושי ורקמות. יחד, טכניקות אלה מספקים assay רגיש כדי לקבוע אם עכבר מהונדס גנטי הוא רגיש יותר לPrCa ו / או ייזום BPH מאשר זני שליטה. Xenografting הוא טכניקה רבת עוצמה עבור in vivo הערכה של הפוטנציאל של תאים ניסיוניים כדי לפתח היסטולוגית ותכונות מולקולריות של ממאירות, כמו גם assay לאסטרטגיות טיפול חדשניים במגוון רחב של מחלות שפירים וממאירים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה והפרוטוקול שתואר במסמך זה מתארים את הייצור של הורמון דחוס ו / או כדורי סמים, וההליך כירורגי להשתלת גלולה תת עורית של עכברים. בהתאם לשאלת המחקר יש לטפל, טכניקה זו יכולה להתבצע ביחידים, או בשילוב עם xenografting הקפסולה הכליות של שתלי תא ערמונית רקומביננטי או xenografts רקמ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לכל חברים במעבדה Ricke, בעבר ובהווה. אנו מודים לקלווין פאטן, הבן, DVM ובריז'יט ראבה, רופאת וטרינרית, על הערות מועילות לגבי הפרוטוקול. ברצוננו להודות NIDDK, NCI, וNIEHS על התמיכה הכספית למחקרים אלה: R01DK093690, R01CA123199, RC2ESO18764. TMN הוא חניך בתכנית ההכשרה הרפואי מדען באוניברסיטת רוצ'סטר שמומן על ידי NIH T32 GM07356; NIH תחת רות ל 'Kirschstein השירות הלאומי לחקר פרס F30DK093173 תומך גם בפרויקט זה. CDV נתמך על ידי T32CA157322 וABT נתמך על ידי T32ES007015 באוניברסיטת ויסקונסין במדיסון. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי למדעי רפואה כלליים או NIH.
Materials
| EQUIPMENT & MATERIALS | |||
| Pellet press | PARR Industries | 2815 | 3mm Punch & Die set |
| Analytical Balance | Ohaus | 1918302 | Voyager or other |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 03-962Q | |
| Dissecting microscope | Leica | L2 | |
| Deltaphase Pad Kit (reheatable wax) | Braintree Scientific | 39DP | Alternative to an electric heating pad |
| Hot Bead sterilizer | F.S.T. | 18000-45 | |
| Isoflurane Vaporizer | Supera Anesthesia Innov | VAP3000 | |
| Induction Chamber | Supera Anesthesia Innov | RES644 | |
| F/AIR Canister | Supera Anesthesia Innov | 80120 | |
| 4 port Manifold | Supera Anesthesia Innov | RES536 | |
| Rebreathing Circuits | Supera Anesthesia Innov | CIR529 | |
| Inlet/Outlet Fittings | Supera Anesthesia Innov | VAP203/4 | |
| Pressure Reg/Gauge | Supera Anesthesia Innov | OXY508 | |
| Oxygen Flowmeter | Supera Anesthesia Innov | OXY660 | |
| 21mm Clear Tubing | Supera Anesthesia Innov | 301-150 | |
| Small Mice Nose Cone | Supera Anesthesia Innov | ACC526 | |
| Sterile surgical gown | Midwest Vet Supply | 350.79866.2 | |
| Surgical mask | Midwest Vet Supply | 350.50111.2 | 2-ply w/ earloops |
| Sterile gauze | Midwest Vet Supply | 001.14100.2 | 2 x 2 inches |
| Sterile Gloves | Kimberly Clark | 55092 | |
| Bouffant | Midwest Vet Supply | 001.27100.2 | |
| Cotton Tip Applicator | Midwest Vet Supply | 001.06220.2 | |
| Surgical Scrub Wash | Midwest Vet Supply | 733.80010.3 | |
| Sterile Fields (Fenestrated) | General Econopak, Inc | 88VCSTF | |
| REAGENTS | |||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C-3292 | |
| Testosterone Proprionate | Sigma-Aldrich | T-1875 | |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E-2758 | |
| Isoflurane | Midwest Vet Supply | 193.33161.3 | |
| Carprofen | Midwest Vet Supply | 193.70200.3 | Injectable (Rimadyl) |
| Betadine | Webster Veterinary | 07-836-3379 | |
| Sterile saline | Midwest Vet Supply | 193.74504.3 | NaCl 0.9%, Injectable |
| SURGICAL INSTRUMENTS | |||
| Straight Sharp/Blunt Scissors | Fine Scientific Tools (F.S.T.) | 14054-13 | |
| Graefe forceps (Serrated, Toothed, Curved) | F.S.T. | 11055-10 | |
| Fine Iris scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Graefe Scalpel | F.S.T. | 10071-12 | |
| Dumont #5 forceps | F.S.T. | 11251-20 | |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | S67050 | 5″ length |
| Graefe forceps (Serrated, Curved) | F.S.T. | 11052-10 | |
| Graefe forceps (Serrated, Straight) | F.S.T. | 11050-10 | |
| Vicryl Suture | Midwest Vet Supply | 295-92100.2 | 4-0, FS-2, Absorbable |
| Needle Holder w/ scissor action | F.S.T. | 12002012 | |
| Wound Clips | Braintree Scientific | ACS CS | May use 7mm or 9mm clips |
| Reflex Wound Clipper | F.S.T. | 12031-09 | Correspond w/ wound clip size |
| Would Clip Remover | F.S.T. | 12033-00 | Universal |
| Sterilization Container | F.S.T. | 20810-01 | Any autoclavable container will do |
| Syringe w/ needle | BD | 148292C | 1cc, 25Gx1 |
| Ear Tag Applicator | National Band & Tag Co. | 1005s1 | Alternative to ear notching |
| Small Animal Ear Tags | National Band & Tag Co. | 1005-1 |
References
- . . Cancer Facts Figures. 4, (2010).
- McVary, K. T. BPH: epidemiology and comorbidities. Am. J. Manag. Care. 12, S122-S128 (2006).
- Nicholson, T. M., Ricke, W. A. Androgens and estrogens in benign prostatic hyperplasia: past, present and future. Differentiation. 82, 184-199 (2011).
- Ricke, W. A., Wang, Y., Cunha, G. R. Steroid hormones and carcinogenesis of the prostate: the role of estrogens. Differentiation. 75, 871-882 (2007).
- Ricke, W. A., et al. Steroid hormones stimulate human prostate cancer progression and metastasis. Int. J. Cancer. 118, 2123-2131 (2006).
- Belanger, A., et al. Changes in serum concentrations of conjugated and unconjugated steroids in 40- to 80-year-old men. J. Clin. Endocrinol. 79, 1086-1090 (1994).
- Nicholson, T. M., et al. Testosterone and 17beta-estradiol induce glandular prostatic growth, bladder outlet obstruction, and voiding dysfunction in male mice. Endocrinology. 153, 5556-5565 (2012).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. J. Vis. Exp. (64), e4013 (2012).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice. J. Vis. Exp. (9), e404 (2007).
- Aamdal, S., Fodstad, O., Nesland, J. M., Pihl, A. Characteristics of human tumour xenografts transplanted under the renal capsule of immunocompetent mice. Brit. J. Cancer. 51, 347-356 (1985).
- Cunha, G. R., Lung, B., Reese, B. Glandular epithelial induction by embryonic mesenchyme in adult bladder epithelium of BALB/c mice. Investigative urology. 17, 302-304 (1980).
- Norman, J. T., Cunha, G. R., Sugimura, Y. The induction of new ductal growth in adult prostatic epithelium in response to an embryonic prostatic inductor. The Prostate. 8, 209-220 (1986).
- Hayward, S. W., et al. Interactions between adult human prostatic epithelium and rat urogenital sinus mesenchyme in a tissue recombination model. Differentiation. 63, 131-140 (1998).
- Wang, Y., et al. A human prostatic epithelial model of hormonal carcinogenesis. Cancer Res. 61, 6064-6072 (2001).
- Ricke, E. A., et al. Androgen hormone action in prostatic carcinogenesis: stromal androgen receptors mediate prostate cancer progression, malignant transformation and metastasis. Carcinogenesis. 33, 1391-1398 (2012).
- Wang, Y., et al. Development and characterization of efficient xenograft models for benign and malignant human prostate tissue. The Prostate. 64, 149-159 (2005).
- Goto, K., et al. Proximal prostatic stem cells are programmed to regenerate a proximal-distal ductal axis. Stem Cells. 24, 1859-1868 (2006).
- Xin, L., Ide, H., Kim, Y., Dubey, P., Witte, O. N. In vivo regeneration of murine prostate from dissociated cell populations of postnatal epithelia and urogenital sinus mesenchyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11896-11903 (2003).
- Priolo, C., et al. Establishment and genomic characterization of mouse xenografts of human primary prostate tumors. Am. J. Pathol. 176, 1901-1913 (2010).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586 (2011).
