Nier Capsule Xenografting en subcutaan Pellet Implantatie voor de Evaluatie van de Prostaat Carcinogenese en benigne prostaathyperplasie
Summary
We beschrijven de productie van samengeperste hormoon pellets, alsmede subcutane chirurgische implantatie in muizen. Deze strategie kan worden gecombineerd met de groei van cellen en weefsels xenotransplantaten onder de renale capsule van athymische naakt muizen hormonale carcinogenese en regulering van benigne prostaat groei te evalueren.
Abstract
Nieuwe therapieën voor twee veel voorkomende prostaataandoeningen, prostaatkanker (PRCA) en benigne prostaathyperplasie (BPH), afhankelijk zijn van de experimenten evalueren van hun hormoonhuishouding. Sex steroïde hormonen (met name oestrogenen en androgenen) zijn belangrijk in PRCA en BPH, we onderzoeken hun respectieve rol in het veroorzaken van de groei prostaat en carcinogenese bij muizen met experimenten met gecomprimeerde hormoon pellets. Hormonen en / of geneesmiddel pellets gemakkelijk vervaardigd met een korrelpers, chirurgisch geïmplanteerd in het subcutane weefsel van de mannelijke muizengastheer. We een protocol beschrijven ook voor de evaluatie van hormonale carcinogenese door het combineren van subcutane hormoon pellet implantatie met xenografting van prostaat cel recombinanten onder de renale capsule van immuungecompromitteerde muizen. Bovendien subcutane hormoon pellet implantatie in combinatie met renale capsule xenografting van BPH weefsel, nuttig voor een beter begrip hormonale regulatie van goedaardige prostaten groei, en nieuwe behandelingen die sex steroïde hormoon pathways testen.
Introduction
Prostaatkanker (PRCA) en benigne prostaathyperplasie (BPH) zijn significant gezondheidslasten. PRCA is de tweede meest voorkomende solide orgaantransplantatie kanker bij mannen en een belangrijke oorzaak van kanker-gerelateerde sterfte 1. BPH is ook zeer vaak voor bij oudere mannen, en er wordt geschat dat de klinische manifestatie van BPH, de lagere urinewegen (LUTS), is van invloed op 50-90% van de mannen 2. Terwijl androgenen en oestrogenen zijn bekend belangrijk om in PRCA en BPH, ons begrip van de hormonale mechanismen die ten grondslag liggen aan het ontstaan van kanker en de groei is nog onvolledig 3,4. Eenvoudige en genetisch handelbaar diermodellen ondersteunen de studies die deze prioriteiten zullen met prostaat onderzoek. In hormoon reagerende aandoeningen zoals PRCA en BPH, het gebruik van subcutane, langzame afgifte hormoon pellets, op zich of in combinatie met een renale capsule xenografting (de overdracht van cellen, weefsels of organen van de ene soort in de andere) in het immunocompromised muisgastheer, biedt een eenvoudige en reproduceerbare methode voor het bestuderen van hormonale regulatie van de groei en carcinogenese.
Subcutaan hormoon pellet implantatie is een eenvoudige en reproduceerbare techniek om hormonale regulatie van carcinogenese en goedaardige groei van de prostaat 5 bestuderen. Subcutane implantatie van volwassen mannelijke muizen met 25 mg testosteron (T) en 2,5 mg 17β-oestradiol (E2), veroorzaakt een toename in serum E2 en geleidelijke afname T, opnieuw de dynamische hormonale milieu van oudere mannen 5,6. Daarnaast is dit model recapituleert veel van de klinische kenmerken van BPH-LUTS 5,7. Alternatieve methoden voor het hormoon toediening omvatten orale / maagsonde of intraperitoneale injectie, die leed veroorzaken bij de knaagdieren, zijn minder consequent in het leveren van dezelfde hoeveelheid geneesmiddel in de tijd, en zijn arbeidsintensiever dan een eenmalige chirurgische implantatie. Andere subcutane modi voor hormone en / of drug delivery omvatten Silastic capsules 8. Terwijl we hebben ook ervaring met het gebruik van Silastic capsules, worden gecomprimeerd pellets favoriet voor hun gebruiksgemak en reproduceerbaarheid. Bovendien afgiftesnelheden van samengeperste hormoon pellets beter na te bootsen de dynamische geslacht steroïde hormoon ratio's waargenomen bij oudere mannen 5,7.
Sinds de ontwikkeling van genetisch immuungecompromitteerde muizen hebben talrijke in vivo modelsystemen waarin xenografting technieken ontwikkeld voor de studie van een grote verscheidenheid van normale en zieke weefsels. Er zijn een aantal standaard categorieën van xenografting. Weefsel xenotransplantaten bestaan uit een klein stukje intacte weefsel, dat een normale structuur, kwaadaardige tumor, of goedaardige groei zijn. Szot et al.. (2007) hebben onlangs verlicht niercapsule xenografting van pancreaseilandjes 9. Aamdal et al.. (1985) beschreven niercapsule xenografting van 27 kanker bij de mens cellijnen in immunocompromised muis biedt 10. Enten kan ook bestaan uit een geïmmortaliseerde cellijn (kanker of niet-tumorigene), of kan bestaan uit een geïmmortaliseerde cellijn in combinatie met cellen geïsoleerd uit mesenchym (cel recombinant graft).
Wij zijn voorstander van xenografting van cel recombinanten de respectieve rol van stroma en epitheel in de ontwikkeling van PRCA en BPH sonde. Cunha et al.. (1980) was de eerste om te melden dat bij volwassen muizen blaas epitheel wordt gecombineerd met embryonale urogenitale sinus mesenchym (UGM) en xenotransplantatie onder de renale capsule van mannelijke muizen gastheren, het weefsel ontwikkelt tot structuren die lijken prostaat acini 11. Norman et al.. (1986) toonden aan dat volwassen muis prostaat ductaal epitheel en UGM, gecombineerd in weefsel recombinanten ondergaan ductale groei en vertakking morfogenese 12. Hayward et al.. (1988) toonden dat menselijke prostaat epitheel aan foetale m inductieveesenchyme soortgelijke wijze 13. Een model van hormonale carcinogenese in de prostaat, door de combinatie van geïmmortaliseerde humane prostaat epitheliale cellijn BPH-1 met UGM, werd eerst beschreven door Wang et al.. 14 (2001) en wordt veelvuldig gebruikt in ons laboratorium 15. Dit model is zeer geschikt voor het begrijpen van PRCA progressie omdat benigne prostaathyperplasie epitheel transformeert naar metastatische ziekte, het modelleren van geavanceerde PRCA bij de mens 5. Omdat specifieke onderdelen genetisch kunnen worden gemanipuleerd, recombinante cel enten is bijzonder bruikbaar als een benadering stroma-epitheliale interacties te evalueren.
Andere sites die geschikt zijn voor xenografting zijn intradermale, subcutane en orthotopische locaties 16. Afhankelijk van het weefsel en ziekteproces plaats kunnen deze geschikt alternatieve benaderingen. Voor de studie van de prostaat hormonale kanker en goedaardige groei regulering, kiezen we de nierkapselsite voor xenografting vanwege de hogere graft nemen tarief, overvloedige bloedtoevoer, en het vermogen om een groter aantal xenograften implanteren in een beperkt plaats 16. Bovendien hormonale manipulatie van de ontvangende muis die resulteert in prostaatatrofie beperkt het gebruik van prostate orthotope enten 16.
Dit protocol beschrijft technieken gecomprimeerde hormoon / geneesmiddel pellet productie en chirurgische implantatie, evenals renale capsule xenografting menselijke prostaatcellen en weefseltransplantaten. Samen vormen deze technieken bieden een gevoelige test om te bepalen of een genetisch gemodificeerde muizen is gevoeliger voor PRCA en / of BPH inleiding dan controlestammen. Xenografting is een krachtige techniek voor in vivo bepaling van de potentie van experimentele cellen histologische en moleculaire kenmerken van maligniteit ontwikkelen, en een test voor nieuwe behandelingsstrategieën voor een breed scala van goedaardige en kwaadaardige ziekten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit document en de beschreven protocol hierin de vervaardiging van gecomprimeerde hormoon en / of drugs pellets, en de chirurgische procedure voor subcutane pellet implantatie van muizen te beschrijven. Afhankelijk van de onderzoeksvraag worden aangepakt, kan deze techniek worden uitgevoerd afzonderlijk, of in combinatie met een nier capsule xenografting van prostaat cel recombinant transplantaten of prostaatweefsel xenograften, welke technieken op grote schaal gebruikt in prostate onderzoek 17-19 zijn. Tezam…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag alle leden van de Ricke lab, heden en verleden te bedanken. Wij danken Calvin Patten, Jr, DVM en Brigitte Raabe, DVM, voor nuttige opmerkingen met betrekking tot het protocol. Wij willen de NIDDK, NCI, en NIEHS erkennen voor hun financiële steun voor deze studies: R01DK093690, R01CA123199, RC2ESO18764. TMN is een stagiair in het Medisch Scientist Training Program aan de Universiteit van Rochester gefinancierd door NIH T32 GM07356; NIH onder Ruth L. Kirschstein National Research Service Award F30DK093173 ondersteunt ook dit project. CDV wordt ondersteund door T32CA157322 en ABT wordt ondersteund door T32ES007015 bij de Universiteit van Wisconsin-Madison. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van het Nationale Instituut van Algemene Medische Wetenschappen of NIH.
Materials
| EQUIPMENT & MATERIALS | |||
| Pellet press | PARR Industries | 2815 | 3mm Punch & Die set |
| Analytical Balance | Ohaus | 1918302 | Voyager or other |
| Bunsen burner | Fisher Scientific | 03-962Q | |
| Dissecting microscope | Leica | L2 | |
| Deltaphase Pad Kit (reheatable wax) | Braintree Scientific | 39DP | Alternative to an electric heating pad |
| Hot Bead sterilizer | F.S.T. | 18000-45 | |
| Isoflurane Vaporizer | Supera Anesthesia Innov | VAP3000 | |
| Induction Chamber | Supera Anesthesia Innov | RES644 | |
| F/AIR Canister | Supera Anesthesia Innov | 80120 | |
| 4 port Manifold | Supera Anesthesia Innov | RES536 | |
| Rebreathing Circuits | Supera Anesthesia Innov | CIR529 | |
| Inlet/Outlet Fittings | Supera Anesthesia Innov | VAP203/4 | |
| Pressure Reg/Gauge | Supera Anesthesia Innov | OXY508 | |
| Oxygen Flowmeter | Supera Anesthesia Innov | OXY660 | |
| 21mm Clear Tubing | Supera Anesthesia Innov | 301-150 | |
| Small Mice Nose Cone | Supera Anesthesia Innov | ACC526 | |
| Sterile surgical gown | Midwest Vet Supply | 350.79866.2 | |
| Surgical mask | Midwest Vet Supply | 350.50111.2 | 2-ply w/ earloops |
| Sterile gauze | Midwest Vet Supply | 001.14100.2 | 2 x 2 inches |
| Sterile Gloves | Kimberly Clark | 55092 | |
| Bouffant | Midwest Vet Supply | 001.27100.2 | |
| Cotton Tip Applicator | Midwest Vet Supply | 001.06220.2 | |
| Surgical Scrub Wash | Midwest Vet Supply | 733.80010.3 | |
| Sterile Fields (Fenestrated) | General Econopak, Inc | 88VCSTF | |
| REAGENTS | |||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C-3292 | |
| Testosterone Proprionate | Sigma-Aldrich | T-1875 | |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E-2758 | |
| Isoflurane | Midwest Vet Supply | 193.33161.3 | |
| Carprofen | Midwest Vet Supply | 193.70200.3 | Injectable (Rimadyl) |
| Betadine | Webster Veterinary | 07-836-3379 | |
| Sterile saline | Midwest Vet Supply | 193.74504.3 | NaCl 0.9%, Injectable |
| SURGICAL INSTRUMENTS | |||
| Straight Sharp/Blunt Scissors | Fine Scientific Tools (F.S.T.) | 14054-13 | |
| Graefe forceps (Serrated, Toothed, Curved) | F.S.T. | 11055-10 | |
| Fine Iris scissors | F.S.T. | 14090-09 | |
| Graefe Scalpel | F.S.T. | 10071-12 | |
| Dumont #5 forceps | F.S.T. | 11251-20 | |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | S67050 | 5″ length |
| Graefe forceps (Serrated, Curved) | F.S.T. | 11052-10 | |
| Graefe forceps (Serrated, Straight) | F.S.T. | 11050-10 | |
| Vicryl Suture | Midwest Vet Supply | 295-92100.2 | 4-0, FS-2, Absorbable |
| Needle Holder w/ scissor action | F.S.T. | 12002012 | |
| Wound Clips | Braintree Scientific | ACS CS | May use 7mm or 9mm clips |
| Reflex Wound Clipper | F.S.T. | 12031-09 | Correspond w/ wound clip size |
| Would Clip Remover | F.S.T. | 12033-00 | Universal |
| Sterilization Container | F.S.T. | 20810-01 | Any autoclavable container will do |
| Syringe w/ needle | BD | 148292C | 1cc, 25Gx1 |
| Ear Tag Applicator | National Band & Tag Co. | 1005s1 | Alternative to ear notching |
| Small Animal Ear Tags | National Band & Tag Co. | 1005-1 |
References
- . . Cancer Facts Figures. 4, (2010).
- McVary, K. T. BPH: epidemiology and comorbidities. Am. J. Manag. Care. 12, S122-S128 (2006).
- Nicholson, T. M., Ricke, W. A. Androgens and estrogens in benign prostatic hyperplasia: past, present and future. Differentiation. 82, 184-199 (2011).
- Ricke, W. A., Wang, Y., Cunha, G. R. Steroid hormones and carcinogenesis of the prostate: the role of estrogens. Differentiation. 75, 871-882 (2007).
- Ricke, W. A., et al. Steroid hormones stimulate human prostate cancer progression and metastasis. Int. J. Cancer. 118, 2123-2131 (2006).
- Belanger, A., et al. Changes in serum concentrations of conjugated and unconjugated steroids in 40- to 80-year-old men. J. Clin. Endocrinol. 79, 1086-1090 (1994).
- Nicholson, T. M., et al. Testosterone and 17beta-estradiol induce glandular prostatic growth, bladder outlet obstruction, and voiding dysfunction in male mice. Endocrinology. 153, 5556-5565 (2012).
- Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol Replacement in Rats and Mice: A Visual Demonstration. J. Vis. Exp. (64), e4013 (2012).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of Pancreatic Islets Into the Kidney Capsule of Diabetic Mice. J. Vis. Exp. (9), e404 (2007).
- Aamdal, S., Fodstad, O., Nesland, J. M., Pihl, A. Characteristics of human tumour xenografts transplanted under the renal capsule of immunocompetent mice. Brit. J. Cancer. 51, 347-356 (1985).
- Cunha, G. R., Lung, B., Reese, B. Glandular epithelial induction by embryonic mesenchyme in adult bladder epithelium of BALB/c mice. Investigative urology. 17, 302-304 (1980).
- Norman, J. T., Cunha, G. R., Sugimura, Y. The induction of new ductal growth in adult prostatic epithelium in response to an embryonic prostatic inductor. The Prostate. 8, 209-220 (1986).
- Hayward, S. W., et al. Interactions between adult human prostatic epithelium and rat urogenital sinus mesenchyme in a tissue recombination model. Differentiation. 63, 131-140 (1998).
- Wang, Y., et al. A human prostatic epithelial model of hormonal carcinogenesis. Cancer Res. 61, 6064-6072 (2001).
- Ricke, E. A., et al. Androgen hormone action in prostatic carcinogenesis: stromal androgen receptors mediate prostate cancer progression, malignant transformation and metastasis. Carcinogenesis. 33, 1391-1398 (2012).
- Wang, Y., et al. Development and characterization of efficient xenograft models for benign and malignant human prostate tissue. The Prostate. 64, 149-159 (2005).
- Goto, K., et al. Proximal prostatic stem cells are programmed to regenerate a proximal-distal ductal axis. Stem Cells. 24, 1859-1868 (2006).
- Xin, L., Ide, H., Kim, Y., Dubey, P., Witte, O. N. In vivo regeneration of murine prostate from dissociated cell populations of postnatal epithelia and urogenital sinus mesenchyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11896-11903 (2003).
- Priolo, C., et al. Establishment and genomic characterization of mouse xenografts of human primary prostate tumors. Am. J. Pathol. 176, 1901-1913 (2010).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J. Vis. Exp. (47), e2586 (2011).
