Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Imaging af biologisk væv ved Desorption elektrosprayionisering massespektrometri

Published: July 12, 2013 doi: 10.3791/50575
Automatic Translation
*1, *1, 1
1School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Desorption elektrospray massespektrometri (DESI-MS) er en omgivende metode, som prøver, herunder biologiske væv, kan afbildes med minimal prøveforberedelse. Ved rastering prøven under ionisering sonden, giver denne spray-baseret teknik tilstrækkelig rumlig opløsning til at skelne molekylære egenskaber af interesse inden vævssnit.

Abstract

Massespektrometri imaging (MSI) indeholder ikke-målrettet molekylær information med den højeste specificitet og rumlig opløsning til at undersøge biologisk væv ved hundredvis til snesevis af mikron skalaen. Når de udføres under omgivelsesbetingelser, prøve forbehandling bliver unødvendige, hvilket forenkler protokollen, samtidig med at den høje kvalitet af de indhentede oplysninger. Desorption elektrosprayionisering (DESI) er en spray-baseret omgivende MSI teknik, der giver mulighed for direkte prøvetagning af overflader i den åbne luft, selv in vivo. Når det bruges med en software-kontrolleret prøve fase prøven bitmapobjekt under DESI ionisering sonde, og gennem tidsdomænet er m / z information korreleret med kemiske arter 'rumlige fordeling. Nøjagtigheden af ​​DESI-MSI udgang afhænger af kilden orientering og positionering i forhold til prøvens overflade og massespektrometer indløb. Heri gennemgår vi, hvordan man forbereder vævssnit for DESI imaging og yderligere eksperimentelle betingelser, der direkte påvirker billedkvaliteten. Konkret beskriver vi protokollen for billedbehandling af rotte hjernevæv sektioner ved DESI-MSI.

Introduction

Målrettede imaging ved massespektrometri letter erhvervelsen af ​​kemiske oplysninger for opdagelse og hypotese-genererende applikationer. Målrettet billeddannelse af en kendt kemisk interesse, på den anden side, kan fremme øget følsomhed og selektivitet gennem specifik metode udvikling. Massespektrometri imaging (MSI) er mest almindeligt udføres på væv ved hjælp af MALDI, 1 sekundær ion massespektrometri (SIMS), 2 og omgivende ionisering teknikker, herunder desorption elektrosprayionisering (DESI), 3 laserablation-elektrosprayionisering (LAESI), 4, 5 og flydende mikro-junction-overfladen prøvetagningssonde (LMJ-SSP). 6. MALDI og SIMS, prøverne skal fjernes fysisk fra prøven, og skal være flad og tynd, da de analyseres under højvakuum. MALDI kræver coating af prøven med en stråling-absorberende matrix, tilføje en ekstra og besværligt skridt til prøven forberedelse. SIMShar den højeste lateral opløsning, men bombardement med meget energirige partikler forårsager omfattende molekylære fragmentering. Derfor MSI ved omgivende metoder udfylde en niche, hvor blødt analyse med minimal prøveforberedelse er ønskelig. Men til dato er alle metoder stadig begrænset af kravet om flade prøve overflader.

DESI anvender en pneumatisk assisteret opkrævet opløsningsmiddel spray rettet mod prøveoverfladen at desorbere og ionisere analytter. 7 arbejdsmodel til desorption og efterfølgende ionisering ved DESI er kendt som "dråben pick-up-model". 8-10 De ladede primære dråber produceret af DESI sonde kolliderer med overfladen, fugtning det og danner en tynd film, i hvilken analysanden opløses ved en faststof-væske mikroekstraktion mekanismen 8 Efterfølgende dråbe kollisioner resulterer i momentum overførsel og start af sekundære dråber indeholdende det ekstraherede materiale fra overfladen . 9,10 sidste ende, gasfase ioner menes at blive produceret gennem ESI-lignende processer efter ion fordampning, charge restkoncentrationer modeller eller andre modeller, 11 dog den præcise iondannelse proces i DESI er endnu ikke eksperimentelt bevist. 12. DESI følsomhed er stærkt afhængig af opløseligheden af analytten i spray opløsningsmiddel som desorption afhængig af lokaliserede mikroekstraktion. 13.

Når det bruges med en software-kontrolleret prøve fase prøven scannes ensrettet med lane stepping under DESI ionisering sonde, og gennem tidsdomænet er m / z information korreleret med kemiske arter af geografisk fordeling (figur 1). Siden den første proof of principle DESI-MSI eksperiment rapporteret af Van Berkel og Kertesz i 2006, er 14 den teknik modnet betragteligt, 15 med rapporterede programmer i lipidanalyser, 3,16 narkotika metabolitter, 17,18 diseaSE biomarkører, 19 hjernevæv, 3,18,20 lungevæv, 18 nyrevæv, 18 testis væv, 18 binyrerne, 17 tyndtlagschromatografi plader, 21 og alger overflader. 22. Den rutinemæssige opløsning af billeder, opnået ved DESI-MSI er 100-200 um, hvilket i sidste ende bestemmes af det effektive overfladeareal ekstraheret med spray, men beslutninger så lavt som 40 um er blevet rapporteret. 23-25 ​​sådan opløsning og nem analyse gør DESI-MSI passende til hurtig og simpel analyse af biologiske vævsprøver med arealer i 0,5-5 cm 2 rækkevidde, der muliggør erhvervelse af værdifulde geografisk information til bedre at forstå biologiske processer 26.. Her, som et eksempel på en typisk DESI-MSI program gennemgår vi de proceduremæssige detaljer at gennemføre et vellykket eksperiment involverer billeddannelse af lipider i rottehjernevæv. De to mest kritiske trin i protokollen ervævspræparatet 27 og DESI ionkilde optimering, som beskrevet nedenfor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Vævssektionering

  1. Store flash-frosne, hele væv i -80 ° C fryser indtil den er klar til skæring.
  2. Tillad vævsprøve at nå den temperatur i cryomicrotome før sektionering (30 min). Indstil klingen og prøvens temperatur til -30 ° C.
  3. Når væv har nået den temperatur, håndtering af prøven med en pincet, skære forsiden eller bagsiden af hjernen afhængigt af hvilken del af hjernen er af interesse for tilstrækkelig monteringsflade (dvs. hvis den forreste del af hjernen er af primær betydning, montere bagsiden af hjernen på chuck).
    1. Påfør ~ 0,5 ml Optimal Cutting Temperatur Compound (OCT, Tissue-Tek, Sakura) til borepatron i centrum og ved hjælp af en pincet, hold prøven på plads i oktober, indtil den størkner. Når OLT helt frosset, mount borepatron i prøve holder.
    2. En minimal mængde OCT anvendes til at montere prøven foretrækkes (i modsætning til montering af modellen i en blok af OLT foretages sædvanligvis i andre histopatologisklogiske procedurer) at minimere kontaminering af prøven. Forurening af prøven ved oktober er til skade for DESI og billedbehandling proces på grund af ion undertrykkelse.
  4. Typiske vævssnit nødvendige for MS billeddannelse interval 12-18 um i tykkelse. Afsnit væv på den ønskede tykkelse inden for det anbefalede interval. Optø montere hver sektioneret væv ved let berøring af en rum-temperatur mikroskop objektglas løbet sektion. Når en prøve er monteret, skal du passe på ikke at røre vævssnittet da det vil ændre de kemiske distributioner og kompositioner.

Bemærk: Vi anbefaler, montere to sektioner pr slide, ved hjælp af en sektion for optimering, og den anden for billeddannelse. Hvis dele ikke er til øjeblikkelig billeddannelse, butik dias i -80 ° C fryser i et dias boks indtil den er klar til analyse.

  1. Hvis analysere lagrede sektioner fjerne dias fra fryseren, som straks flyttes til vakuum og tillade ~ 15-20min at tø. Forlader prøven i ekssikkatoren længere vil tørre prøven og reducere DESI effektivitet. Optimering af DESI ionkilde vil ske med vævsprøven når den er optøet, men af ​​hensyn til tiden, den periode, hvor prøven optøning tjener som en ideel tid til initialisering af udstyret.
    1. Anvendelse af acetonitril med 1% eddikesyre som DESI opløsningsmiddel tænde sprøjtepumpen med en strømningshastighed på 5 ul / min. En lavere strømningshastighed vil mindske spot side af DESI spray og effektiv pixelstørrelse, men en højere strømningshastighed kan være nødvendig for tilstrækkelig følsomhed. Derfor strømningshastigheden (typisk 1-5 gl / min) skal optimeres til hver anvendelse og den ønskede følsomhed og opløsning. Sørg for, at sprøjten indeholder nok solvens til komplet optimering og billedbehandling ved en given strømningshastighed.
    2. Når opløsningsmidlet vises drypper ud af kilden tip, tænde for kvælstof nebulizing gas med pressure på 160 psi.
    3. Tænd for højspændings strømforsyning tilsluttet ionkilde anvender 3.600 V.
  2. Monter slide om forslaget scenen og begynder ionkilde og MS optimering

2.. DESI Optimering

  1. Det DESI Systemet består af en kilde sonde (se figur 2), en sprøjte og pumpe eller alternativt opløsningsmiddel delivery system, komprimeret nitrogen, oversættelse prøve scenen og mount. Fortsæt med DESI source optimering når massespektrometer er blevet tunet til passende masseintervallet og analytter af interesse.
    1. Hvis kildekomponenter ikke blevet tændt endnu, henvises til punkt 1.5.1-3 til retninger.
    2. De variabler diskuteret i disse afsnit anbefales til billeddannelse af biologisk væv. Men disse variabler skal optimeres til forskellige typer af væv eller prøve. Alternative opløsningsmidler, strømningshastigheder, nebulizing gastryk og spændinger er blevet rapporteret for fantasing af biologiske væv. 16-18
  2. Sørg for, at i første omgang DESI kilden ikke rører glasset dias, og ikke rettet mod nogen del af vævssnittet. Dette vil sikre, at sonden ikke er beskadiget i den indledende optimeringsproces og vil ikke forurene nogen del af sættet op ved at komme i kontakt med vævsprøven.
    1. En god udgangsposition er med spidsen 3 mm fra prøveoverfladen og 5 mm fra MS kapillære indgang, med sonden i en vinkel på 55 ° i forhold til prøvens overflade. Den indre kapillar af DESI sonden bør udvide ~ 1 mm ud over det ydre kapillarrøret. Alle disse parametre vil blive optimeret.
  3. MS interfacet kapillar bør have en samling vinkel på ~ 15 ° i forhold til prøvens overflade for optimal overførsel af ioner. Juster scenen højde, så MS kapillar svæver over prøvens overflade, kapillar bør være <1 mm fra overfladen, så tæt som muligtuden at røre.
  4. Juster DESI sonden i x dimensionen med hensyn til MS kapillære indløb, således at de er direkte på linje.
  5. Juster y og z positioner af DESI kilde til optimal følsomhed med ekstra væv sektion. Bemærk, at da DESI sonden er rettet mod én prøve område, vil det i sidste ende desorbere og ionisere alle analytter i dette område, og signalet vil gradvist aftage som dette sker. Udfører dette trin så hurtigt som muligt er vigtigt.
    1. Derfor hele optimeringsproces, skal prøven skal flyttes under sprøjtehovedet at sikre, at frisk prøve bliver analyseret, og at eventuelle ændringer i signalet skyldes kilde optimering, ikke prøve udtynding. Men i betragtning af, at det varierede kemiske sammensætning af forskellige regioner i vævet, en direkte sammenligning af ion-intensitet over hele vævssnit ikke er helt præcis. Thalamus af hjernen giver en rimelig stor størrelse område medmere ensartet kemisk sammensætning, men stadig ikke helt ensartet. Alternativt, en mærkning af rød Sharpie, som indeholder farvestoffet rhodamin 6G ([M] +, m / z 443), på objektglasset væk fra prøven giver en stærk MS reaktion ved DESI og kan også anvendes til optimering, men i betragtning af den forskellige prøve form og analyt, kan disse betingelser stadig ikke korrelere til en ideel set-up til biologisk væv.
    2. Anbefalet y adskillelse mellem kilde spids og kapillær indløb: ~ 4 mm, anbefales z adskillelse mellem spids og prøveoverflade: ~ 1,5 mm. Selv om disse parametre vil være lidt anderledes for hver eksperimentelle set-up.
    3. Overvejer geometri og vinklen af ​​sonden, i betragtning af, at y og z-dimension positioner er indbyrdes forbundne med hensyn til effektiv overførsel af opløsningsmidlet og analyt-holdige dråber tage. En ændring i en variabel vil kræve en efterfølgende ændring i den anden for at opretholde den samme spray anslagsposition ogdets transmission vinkler.
  6. Juster afstanden de indre kapillar udstødes den ydre kapillar af kilden for maksimal følsomhed og minimal effekt punktstørrelse. Forsigtig: Sørg for, at den høje spænding er OFF, samtidig med at denne justering.
  7. Kilden geometri vil blive betragtet optimale, når det maksimale signal observeres.
    1. De variabler optimeret i afsnit 2.5-2.6 er indbyrdes forbundne, således tilpasningen af ​​en vil i sagens natur kræve omlægning af den anden til at opretholde den nødvendige source-sample-indløb geometri, eller justering af betingelser diskuteret i afsnit 1.5.1- 3..
  8. Derudover kan en varmeelement omkring overførslen kapillarrøret massespektrometer forbedre følsomheden ved at lette desolvatisering af de ladede analyt dråber produceret under ionisering proces. Her bruger vi et reb varmelegeme snoet omkring overførslen kapillar indstillet til 100 ° C.

3.. Tissue Imaging

  1. Under billeddannende proces bevæger prøven fase prøven under DESI sonde og MS indløb kapillar og alle andre komponenter forbliver stationær. De bevægelse parametre scenen bør vælges på grundlag af DESI indvirkning plume størrelse og optimal følsomhed.
    1. En markant virkning fane vil resultere i en højere ion intensitet, eftersom mere prøve desorberes dog til billeddannelse, vil det også resultere i en større pixelstørrelse og dermed dårligere billedopløsning.
  2. Oversættelsen stadium anvendes i dette eksperiment er hjemme-bygget og styres af et LabView program, der giver mulighed for styring af rastering hastighed og linjeafstand for et billede af givne dimensioner. Scenen motion control VI anvendt i dette eksperiment er tilgængelig på omnispect.bme.gatech.edu. Alternativt kunne en kommercielt tilgængelig DESI kilde og trin kan anvendes, såsom 2D automatiserede Omni Spray kilde fra Prosolia Inc. (Indianapolis, IN USA).
    1. For hjernevæv entypiske billede størrelse er 10 x 15 mm, og i betragtning af scenen motion anvendte parametre, vil billedet tage ca 3 timer.
      1. Program til LabView VI eller tilsvarende kontrol software for ønskede billeddannelse forhold ved hjælp af en scene scanningshastighed på 80 um / sek og linjeafstand mellem rækker af 200 um. Når du bruger Omni Spray kilde, bør motion parametre være indstillet til en scanning hastighed på 100-200 um / sek og en linjeafstand på 200 um. Bemærk, at disse motion parametre kan ændres afhængigt af antallet af ønskede pixels i hver dimension og nødvendige følsomhed.
        1. En mindre linjeafstand har vist sig at forbedre billedkvaliteten, med scanningshastighed har mindre effekt. 25. Det er imidlertid væsentligt at bemærke, at dette ikke nødvendigvis ensbetydende og forbedret billedopløsning, som er stærkt afhængig af virkningen spot størrelse. En langsommere scan hastighed og mindre linjeafstand vil øge tidspunktet for analyse og skal derfor optimeringzed for hver type væv eller prøve.
      2. Med MS spektrale erhvervelse sat til 1 scan / sekund, og billedet oprettet som 1 pixel / scan, scenen hastigheden definerer pixelstørrelsen i x dimension, mens linjeafstand bestemmer pixelstørrelsen i y dimension. Selv om den sande pixelstørrelse i billedet er større end dette på grund sprøjte spredning langsommere bevægelse giver mere tid til desorption og detektion af analytter.
    2. Giv stien og filnavnet for position og tid filer, der skal registreres under billederne i LabView VI.
  3. Som forberedelse til massespektralanalyse dataopsamling, beregne den samlede tid, der kræves til billeddannelse. LabVIEW program, der benyttes af vores gruppe giver automatisk denne værdi, men hvis alternative stadium kontrol bruges, denne beregning er nødvendig for MS datafangst indstillinger.
    1. Ved anvendelse af en Omni Spray automatiseret kilde og tidspunkt er hver linie af billedet erhvervet som iindividuel kører. Den tid-per-linje og antallet af linjer, der er nødvendige for givne billeddannelse dimensioner er beregnet ved hjælp af Omni Spray kontrol software til at være input til massespektrometer software.
  4. Sørg for, at massespektrometer scan hastighed er 1 spektrum / sek, og indstille instrumentet købet tid til at matche den samlede beregnede tid.
    1. Set spektral scanningshastighed til 1 spektrum / sek.
    2. Anskaf data i PROFIL tilstand og sikre, at m / z interval er passende for arten af ​​interesse. Husk, at DESI producerer også formere ladede analytter, som i ESI.
    3. Indstil købet tid til at matche den samlede billede tid givet af LabView.
  5. Placer spray virkningen stedet i øverste venstre af det område, der skal afbildes.
  6. Begynd køb af MS-data og fase motion samtidigt.
  7. Ved afslutningen af ​​datafangst, vende massespektrometer til standbytilstand.
  8. Sluk højspænding DESI kilde.
  9. Drej off nitrogengas.
  10. Sluk sprøjtepumpe.

4.. Image Processing

  1. Massespektrumdata skal i kombination med fase tid og positionsdata gemt som tekstfiler via LabView være "foldes" i en 2D-billede korrelere koordinater pixels med de tilsvarende spektre. Billederne præsenteres her blev behandlet ved hjælp af Matlab-baserede software, der er frit tilgængelig på: omnispect.bme.gatech.edu. Hvis data er erhvervet ved hjælp af Omni Spray kilde, er Firefly datakonvertering software, der bruges til at skabe datakube til billedbehandling visualisering i BioMAP (www.maldi-msi.org).
  2. For data indhentet på Jeol AccuTOF massespektrometer, skal registreres kromatogram skal udføres i. Cdf format til yderligere analyse.
    1. Brug af DataManager inden MassCenter, først konvertere erhvervede data til centroided data (Tools → Konverter acquistion Data Centroid). Derefter eksportere data. CDF-format ved hjælp af tastaturet kombination Ctrl + Shift + E folefterfulgt af Værktøjer → Eksporter.
  3. Upload de rå. Kontinuerlig drift massespektraldata, og de to tekstfiler, position og tid, til den OmniSpect hjemmeside. Firefly-behandlede billeddata kan visualiseres i BioMAP.
    1. Yderligere behandling af data, herunder statistisk analyse af ikke-negativ matrix Faktorisering eller afbilde en enkelt ion af interesse kan udføres direkte på hjemmesiden.
    2. Alternativt kan de rå data kuben eksporteres til analyse i Matlab.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 3 viser et repræsentativt spektrum opnået fra en ubehandlet rottehjerne sektion. I positiv modus massespektret domineret af phosphatidylcholiner grundet deres høje ionisering effektivitet (tilskrevet det positivt ladede kvaternære ammonium-gruppe). Den samlede ion billede af vævssnittet er også vist i figur 3, der viser rigelige signal over hele hjernen sektion. Vigtige detekterede lipider er identificeret i tabel 1, ved litteratur sammenligninger.

Den rumlige fordeling af eksempel lipider (figur 4) viser, hvordan den relative forekomst af forskellige phosphatidylcholin arter varierer mellem grå og hvide substans i hjernen. For eksempel [PC 34:1 + K] +, m / z 798,5364, viser øget intensitet i cerebellare cortex (grå substans), mens [PC 36:1 + K] +, m / z 826,5558, viser øget intensitet i den cerebellare Skaftet (WHIte tørstof). Det sammensatte billede opnået for de to ioner (figur 4c) fremhæver kontrasten i lipid fordeling over vævssnittet. De rumlige fordelinger af andre vigtige lipider i hjernen er også opført i tabel 1.. Disse distributioner er enig med tidligere undersøgelser. 28-30

Figur 1
Figur 1. Skematisk af DESI-MSI imaging proces. DESI (a) anvendes til overfladen analyse af væv, og når prøven bitmapobjekt i en kontrolleret bevægelse (b) nedenfor kilden massespektraldata, intensitet vs m / z (c ), som en funktion af tid (d) er erhvervet. Disse data er derefter korreleret gennem tidsdomænet med bevægelse parametre til dannelse af en kemisk billede(E). Klik her for at se større figur .

Figur 2
Figur 2. Skematisk DESI kilde.

Figur 3
Figur 3. Gennemsnitlig hel-væv spektret med mere rigelige m / z-værdier mærkede (a) og total ion billede (b) erhvervet af DESI-MSI i positiv ion-mode.

Figur 4 Figur 4.. Udvalgte ion billeder af vigtige phosphocholiner hos rotter hjernevæv erhvervet ved DESI-MSI i positiv ion-mode (a) [PC 34:1 + K] +, m / z 798,5364 (b) [PC 36:1 + K] + , m / z 826.5558 (c) sammensat billede af m / z 798, blå, og 826, røde.

Arter m / z Lokalisering (stof)
[PC 32:0 + Na] + 756.5335 Gray
[PC 32:0 + K] + 772.5165 Gray
[PC 36:4 + H] + 782.5477 White
[PC 34:1 + K] + 798.5364 Gray
[PC 38:4 + H] + White
[PC 36:1 + K] + 826.5558 White

Tabel 1. Vigtige lipid identiteter og lokalisering i hjernen sektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Optimering af DESI kilde geometri er afgørende for en vellykket MSI eksperimenter. De mange variabler der bidrager til tilpasningen af ​​systemet direkte påvirker følsomheden og billedopløsning. Hvis der under optimering, forsøgslederen har vanskeligheder ved at få signal, anbefaler vi at bruge rød Sharpie spot trukket på diaset som et benchmark, farvestoffet, rhodamin 6G, m / z 443, producerer et stærkt signal i den positive ion-mode og kan bruges til indledende optimering. Derudover valg af opløsningsmiddel til DESI er afgørende for sensitivitet, som analyt transmission og ionisering afhænger udvinding af analysanden fra overfladen ind i den tynde dannede film. 13. Mange elektrosprayionisering-kompatible opløsningsmidler og blandinger kan anvendes til at bistå med desolvatisering og ionisering proces afhængig af den klasse af forbindelse med renter i analysen.

Som tidligere nævnt, opløsningen af ​​DESI-MS billede depeNDS primært på kilden geometri. Billede beslutning om i størrelsesordenen 200 um regelmæssigt opnås ved DESI-MSI, selvom dette er højere end laser-baserede og / eller i vakuum billeddiagnostiske metoder, der kan spænde fra ~ 10-150 um. 5,31 opløsning så højt som 40 pm er blevet rapporteret ved anvendelse af DESI, 24 dog 200 um til rutinemæssig billeddannelse er tilstrækkelig til analyse af store biologiske vævssnit. Kvaliteten af ​​den indre kvartsglas kapillær af DESI kilde vil også påvirke billedkvaliteten og opløsning. Den anbefalede indvendige diameter af kapillarrøret er 50 um, som stort id kapillærer producere større spray og større billedopløsning. 25. Hvis dette kapillær ikke skæres holdent eller er revnet, vil sprayen ikke være konisk resulterer i uregelmæssigt formet virkning stedet, dårlig kvalitet og reproducerbare billeder.

Ikke alene kilden geometri påvirke løsningen af ​​DESI-MSI, det spiller også en væsentlig rolle i følsomhedaf fremgangsmåden. Derfor geometri skal optimeres og holdes konstant under hele proceduren. Hvis prøven ikke er plane eller ikke er monteret helt vandret, vil kilden geometri ændre sig, og dermed ændre svaret og skabe et artefakt i billedet. 23 Selv DESI-MSI er begrænset til plane prøver, er 3D billeddannelse af biologisk væv lavet muligt gennem 2D billeddannelse af serielle vævssnit som derefter stables i et tredimensionelt billede. 32. Denne fremgangsmåde kan også anvendes til andre MSI metoder, herunder SIMS, MALDI, LAESI etc. 33 Tredimensionelle massespektrometri billeder kan også være skabt af den gradvise fjernelse af lag af materiale ved laserpulser for eksempel, og reimaging. 34.

Den positive indstilling analyse af rottehjernevæv letter vellykket billeddannelse af fosfatidylcholiner og visse lægemidler og metabolitter. 18. For at supplere denne analyse, billedbehandling i negative-tilstand producerer et spektrum med en større mangfoldighed af klasser af lipider, 28,35, og kan bruges til at give en samlet analyse af vævssnit. I tilfælde, hvor mere end én lipid arter kan henføres til en bestemt m / z-værdi, kan tandem massespektrometri anvendes til identifikation. Tandem massespektrometri fungerer også som en yderligere metode lipid identitet bekræftelse. 35.

Ambient massespektrometri billeddannelse ved DESI har vist sig at være effektiv i billeddannelse af lipidarter i rotter hjernevæv. Indhentet gennem MSI eksperimenter kan give indsigt i sygdomme forbundet med ændrede niveauer af phospholipider, såsom Alzheimer sygdom, Downs syndrom og diabetes, blandt andre. 36-38 betragtning af den høje forekomst af lipider og deres roller i biologiske processer, mange biologiske systemer findes der ville få gavn af informationen fås via massespektrometri billeddannelse. Med mange potentielle metodertil billede biologiske prøver ved anvendelse af massespektrometri, omgivende ionisering metoder DESI i særdeleshed et middel til at gøre det med reduceret prøveforberedelse levere og øget brugervenlighed analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde understøttes af ARRA NSF MRI Instrument Development tilskud # 0923179 til FMF. Vi takker Aqua Asberry, Lab koordinator for Parker H. Petit Institut for bioteknologi og Biosciences Histology Core, for at få hjælp med vævssektionering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura-Finetek 4583 http://www.sakuraeu.com/products/showitem.asp?cat=11&subcat=48
Acetonitrile EMD AX0156-6 OmniSolv, LC-MS Grade
Acetic Acid Sigma Aldrich 695092-500 ml
Equipment
Cryostat microtome Thermo Scientific CryoStar* NX70 Any available microtome can be used for tissue sectioning http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail?productId=13958375&groupType=PRODUCT&searchType=0&storeId=11152&from=search&ca=cryostar
Omni Spray®DESI Spray Head Prosolia Inc. Can also use the 2-D Omni Spray® Source kit instead of assembling components of imaging experiment http://www.prosolia.com/sources.php
High Voltage Power Supply Stanford Research Systems, Inc. PS350/5000V-25W http://www.thinksrs.com/products/PS300.htm
Rope heater, RTD, controller Omega http://www.omega.com/toc_asp/subsectionSC.asp?subsection=M02&book=Heaters
Labview National Instruments Version 7.1
Translational stage Prior Scientific Optiscan II http://www.prior.com/productinfo_auto_motorized_optiscan.html
AccuTOF Mass Spectrometer JEOL JMS-T100LC Can use any mass spectrometer equipped with an extended capillary atmospheric pressure interface

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular Imaging of Biological Samples: Localization of Peptides and Proteins Using MALDI-TOF MS. Anal. Chem. 69, 4751-4760 (1997).
  2. Pacholski, M. L., Winograd, N. Imaging with Mass Spectrometry. Chem. Rev. 99, 2977-3006 (1999).
  3. Wiseman, J. M., Ifa, D. R., Song, Q., Cooks, R. G. Tissue Imaging at Atmospheric Pressure Using Desorption Electrospray Ionization (DESI) Mass Spectrometry. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7188-7192 (2006).
  4. Nemes, P., Laser Vertes, A. Laser Ablation Electrospray Ionization for Atmospheric Pressure, in Vivo, and Imaging Mass Spectrometry. Anal. Chem. 79, 8098-8106 (2007).
  5. Nemes, P., Vertes, A. Atmospheric-pressure Molecular Imaging of Biological Tissues and Biofilms by LAESI Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (43), e2097 (2010).
  6. Van Berkel, G. J., Kertesz, V., Koeplinger, K. A., Vavrek, M., Kong, A. -N. T. Liquid microjunction surface sampling probe electrospray mass spectrometry for detection of drugs and metabolites in thin tissue sections. J. Mass Spectrom. 43, 500-508 (2008).
  7. Takáts, Z., Wiseman, J. M., Gologan, B., Cooks, R. G. Mass Spectrometry Sampling Under Ambient Conditions with Desorption Electrospray Ionization. Science. 306, 471-473 (2004).
  8. Venter, A., Sojka, P. E., Cooks, R. G. Droplet Dynamics and Ionization Mechanisms in Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chem. 78, 8549-8555 (2006).
  9. Costa, A. B., Cooks, R. G. Simulation of atmospheric transport and droplet-thin film collisions in desorption electrospray ionization. Chem. Commun. , 3915-3917 (2007).
  10. Costa, A. B., Graham Cooks, R. Simulated splashes: Elucidating the mechanism of desorption electrospray ionization mass spectrometry. Chem. Phys. Lett. 464, 1-8 (2008).
  11. Konermann, L., Ahadi, E., Rodriguez, A. D., Vahidi, S. Unraveling the Mechanism of Electrospray Ionization. Anal. Chem. 85, 2-9 (2012).
  12. Kebarle, P., Verkerk, U. H. Electrospray: From ions in solution to ions in the gas phase, what we know now. Mass Spectrom. Rev. 28, 898-917 (2009).
  13. Green, F. M., Salter, T. L., Gilmore, I. S., Stokes, P., O'Connor, G. The effect of electrospray solvent composition on desorption electrospray ionisation (DESI) efficiency and spatial resolution. Analyst. 135, 731-737 (2010).
  14. Van Berkel, G. J., Kertesz, V. Automated Sampling and Imaging of Analytes Separated on Thin-Layer Chromatography Plates Using Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chem. 78, 4938-4944 (2006).
  15. Ifa, D. R., Wu, C., Ouyang, Z., Cooks, R. G. Desorption electrospray ionization and other ambient ionization methods: current progress and preview. Analyst. 135, 669-681 (2010).
  16. Eberlin, L. S., Ferreira, C. R., Dill, A. L., Ifa, D. R., Cooks, R. G. Desorption electrospray ionization mass spectrometry for lipid characterization and biological tissue imaging. Biochim. Biophys. Acta. 1811, 946-960 (2011).
  17. Wu, C., Ifa, D. R., Manicke, N. E., Cooks, R. G. Molecular imaging of adrenal gland by desorption electrospray ionization mass spectrometry. Analyst. 135, 28-32 (2010).
  18. Wiseman, J. M., et al. Desorption electrospray ionization mass spectrometry: Imaging drugs and metabolites in tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. 105, 18120-18125 (2008).
  19. Eberlin, L. S., et al. Classifying Human Brain Tumors by Lipid Imaging with Mass Spectrometry. Cancer Res. 72, 645-654 (2012).
  20. Wiseman, J. M., Ifa, D. R., Venter, A., Cooks, R. G. Ambient molecular imaging by desorption electrospray ionization mass spectrometry. Nat. Protocols. 3, 517-524 (2008).
  21. Van Berkel, G. J., Ford, M. J., Deibel, M. A. Thin-Layer Chromatography and Mass Spectrometry Coupled Using Desorption Electrospray Ionization. Anal. Chem. 77, 1207-1215 (2005).
  22. Lane, A. L., et al. Desorption electrospray ionization mass spectrometry reveals surface-mediated antifungal chemical defense of a tropical seaweed. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 7314-7319 (2009).
  23. Kertesz, V., Van Berkel, G. J. Scanning and Surface Alignment Considerations in Chemical Imaging with Desorption Electrospray Mass Spectrometry. Anal. Chem. 80, 1027-1032 (2008).
  24. Kertesz, V., Van Berkel, G. J. Improved imaging resolution in desorption electrospray ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 22, 2639-2644 (2008).
  25. Campbell, D., Ferreira, C., Eberlin, L., Cooks, R. Improved spatial resolution in the imaging of biological tissue using desorption electrospray ionization. Anal. Bioanal. Chem. 404, 389-398 (2012).
  26. Chaurand, P., Cornett, D. S., Angel, P. M., Caprioli, R. M. From Whole-body Sections Down to Cellular Level, Multiscale Imaging of Phospholipids by MALDI Mass Spectrometry. Mol. Cell. Proteomics. 10, (2011).
  27. Dill, A., Eberlin, L., Costa, A., Ifa, D., Cooks, R. Data quality in tissue analysis using desorption electrospray ionization. Anal. Bioanal. Chem. 401, 1949-1961 (2011).
  28. Jackson, S. N., Wang, H. -Y. J., Woods, A. S. Direct Profiling of Lipid Distribution in Brain Tissue Using MALDI-TOFMS. Anal. Chem. 77, 4523-4527 (2005).
  29. Jackson, S. N., et al. MALDI-ion mobility-TOFMS imaging of lipids in rat brain tissue. J. Mass Spectrom. 42, 1093-1098 (2007).
  30. Wang, H. -Y. J., Post, S. N. J. J., Woods, A. S. A minimalist approach to MALDI imaging of glycerophospholipids and sphingolipids in rat brain sections. Int. J. Mass Spectrom. 278, 143-149 (2008).
  31. Wu, B., Becker, J. S. Imaging of elements and molecules in biological tissues and cells in the low-micrometer and nanometer range. Int. J. Mass Spectrom. 307, 112-122 (2011).
  32. Eberlin, L. S., Ifa, D. R., Wu, C., Cooks, R. G. Three-Dimensional Vizualization of Mouse Brain by Lipid Analysis Using Ambient Ionization Mass Spectrometry. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 873-876 (2010).
  33. Seeley, E. H., Caprioli, R. M. 3D Imaging by Mass Spectrometry: A New Frontier. Anal. Chem. 84, 2105-2110 (2012).
  34. Nemes, P., Barton, A. A., Vertes, A. Three-Dimensional Imaging of Metabolites in Tissues under Ambient Conditions by Laser Ablation Electrospray Ionization Mass Spectrometry. Anal. Chem. 81, 6668-6675 (2009).
  35. Pulfer, M., Murphy, R. C. Electrospray mass spectrometry of phospholipids. Mass Spectrom. Rev. 22, 332-364 (2003).
  36. Han, X., Holtzman, D. M., McKeel, D. W. Plasmalogen deficiency in early Alzheimer's disease subjects and in animal models: molecular characterization using electrospray ionization mass spectrometry. J. Neurochem. 77, 1168-1180 (2001).
  37. Murphy, E. J., Schapiro, M. B., Rapoport, S. I., Shetty, H. U. Phospholipid composition and levels are altered in down syndrome brain. Brain Res. 867, 9-18 (2000).
  38. Han, X., et al. Alterations in Myocardial Cardiolipin Content and Composition Occur at the Very Earliest Stages of Diabetes: A Shotgun Lipidomics Study. Biochemistry. 46, 6417-6428 (2007).

Tags

Bioteknik Molekylærbiologisk Institut Biomedical Engineering kemi biokemi biofysik fysik cellebiologi Molecular Imaging massespektrometri MS MSI Desorption elektrosprayionisering DESI Ambient massespektrometri væv sektionering biomarkør billedbehandling

Erratum

Formal Correction: Erratum: Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry
Posted by JoVE Editors on 02/13/2014. Citeable Link.

A correction was made to Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. There was an error with an author's name. The author's surname was appended with a missing character:

Rachel V. Bennett

instead of:

Rachel V. Bennet

Imaging af biologisk væv ved Desorption elektrosprayionisering massespektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bennett, R. V., Gamage, C. M.,… More

Bennett, R. V., Gamage, C. M., Fernández, F. M. Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (77), e50575, doi:10.3791/50575 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter