Isolatie, zuivering en etikettering van de Muis Bone Marrow Neutrophils voor functionele studies en adoptieve overdracht Experimenten

Summary

We beschrijven een protocol voor isolatie en zuivering van neutrofielen van muizen beenmerg door dichtheidsgradiënt centrifugatie en neutrofielen labeling met CellTracker kleurstoffen. Dit is een eenvoudige, snelle, reproduceerbare en economische methode voor het verkrijgen van grote aantallen neutrofielen voor downstream functionele studies of adoptieve overdracht en experimenten volgen.

Abstract

Neutrofielen zijn kritisch effector cellen van het aangeboren immuunsysteem. Ze zijn snel aangeworven op plaatsen van acute ontsteking en oefenen beschermende of pathogene effecten, afhankelijk van de inflammatoire milieu. Toch, ondanks de onmisbare rol van neutrofielen bij de immuniteit, gedetailleerd inzicht in de moleculaire factoren die neutrofielen 'effector en immunopathogene effecten in verschillende infectieziekten en ontstekingen bemiddelen ontbreekt nog, deels vanwege hun korte halfwaardetijd, de problemen met de afhandeling van deze cellen en het ontbreken van betrouwbare experimentele protocollen voor het verkrijgen van voldoende aantallen neutrofielen voor downstream functionele studies en adoptieve overdracht experimenten. Daarom, eenvoudige, snelle, zuinige en betrouwbare methoden zijn zeer wenselijk voor het oogsten van voldoende aantallen muis neutrofielen voor het beoordelen van functies zoals fagocytose, moord, cytokine productie, degranulatie en mensenhandel. Daartoepresenteren wij een reproduceerbare dichtheidsgradiënt centrifugatie gebaseerd protocol kan worden aangepast in een laboratorium grote aantallen neutrofielen isoleren uit het beenmerg van muizen met een hoge zuiverheid en levensvatbaarheid. Bovendien presenteren we een eenvoudig protocol dat CellTracker kleurstoffen gebruikt om de geïsoleerde neutrofielen, die vervolgens kunnen adoptief overgebracht in ontvangende muizen en bijgehouden in verscheidene weefsels ten minste 4 uur na overdracht met flowcytometrie label. Met deze aanpak kan differentiële labeling van neutrofielen van wild-type en gen-deficiënte muizen met verschillende CellTracker kleurstoffen met succes worden gebruikt om concurrerende herbevolking studies uit te voeren voor het evalueren van de directe rol van specifieke genen in de handel van neutrofielen uit het bloed in doelweefsels in vivo .

Introduction

Neutrofielen zijn de meest voorkomende leukocyten in de mens. Zij zijn de belangrijkste cellulaire component van het aangeboren immuunsysteem en fungeren als een eerste lijn van verdediging tegen binnendringende micro-organismen. Patiënten met verworven neutropenie en primaire immuundeficiënties dat neutrofielen nummers en / of functie beïnvloeden de ontwikkeling van levensbedreigende invasieve bacteriële en schimmelinfecties, met de nadruk op het belang van deze cellen in de afweer ^1. Immuunherkenning van binnendringende ziekteverwekkers op de infectieplaats door hun verwante patroonherkenning receptoren resulteert in de inductie van een georkestreerde aangeboren immuunreactie, wat leidt tot uitscheiding van chemoattractants een chemotactische gradiënt kan werven neutrofielen uit het bloed in ontstoken weefsel ² genereren . Na neutrofielen alstublieft de besmettingsplaats, worden ze geactiveerd, wat leidt tot cytokine en chemokine productie pathogeen opname en doden via oxidatieve en niet-oxidatieve mechanisms ^3. Naast hun goed-erkende rol in aangeboren immuniteit, neutrofielen zijn ook onlangs aangetoond dat een belangrijke rol spelen als initiatiefnemers van effectieve adaptieve immuunreacties ^4. Anderzijds, los van hun beschermende rol in immuniteit, neutrofielen bemiddelen ook weefselschade en immunopathologie door overmatige accumulatie en / of activatie op plaatsen van ontsteking, zoals getoond in diverse infectieziekten en auto-immuunziekten ^5-7.

Ondanks de onmisbare rol van neutrofielen bij de montage effectieve aangeboren immuunrespons en hun pleiotropische effector functies in diverse infectieziekten en ontstekingen, technische problemen met de behandeling van deze cellen en het ontbreken van betrouwbare experimentele protocollen heeft belemmerd onderzoek met een aantal neutrofielen in de afgelopen decennia. Daarom wordt gebruik van reproduceerbare assays voor isolatie van neutrofielen moet verder onderzoek neutrofiel-gemedieerde immunolo vergemakkelijkengische functies ex vivo en in vivo. Tot op heden zijn verscheidene werkwijzen beschreven voor het isoleren van neutrofielen zoals dichtheidsgradiënt centrifugering van bloed en muis bloed of beenmerg ^8,9, positieve of negatieve immunomagnetische verrijking van neutrofielen van muizen bloed of beenmerg ^10,11 en oogsten van neutrofielen uit de peritoneale holte van muizen na intraperitoneale injectie van thioglycollaat of andere inflammatoire middelen ^12. Hoewel neutrofielen gemakkelijk afzonderlijk in grote aantallen uit menselijk bloed, deze methode niet optimaal bij muizen vanwege de beperkte hoeveelheid muizenbloed die isolatie voldoende neutrofielen voor functionele studies of adoptieve overdrachtsexperimenten ¹³ uitsluit. Bovendien, hoewel de opbrengst van thioglycollaat-opgewekte cellen van de peritoneale holte groter is vergeleken met die van muizenbloed, de zuiverheid van neutrofielen in de inflammatoire peritoneale lavage varieert60-90%, en de geïsoleerde neutrofielen vertonen een geactiveerde fenotype. Aldus, de cellen verzameld met deze methode alleen gebruikt voor het uitvoeren van functionele studies van geactiveerde, maar niet die van niet-gestimuleerde neutrofielen, zoals de muis peritoneale holte weinig neutrofielen bij het ​​stationaire ^12. In plaats daarvan, het beenmerg is handig reservoir voor het oogsten grote aantallen of ongestimuleerde of geactiveerde neutrofielen ^11,14, die vervolgens kunnen worden gebruikt voor stroomafwaartse functionele studies zoals fagocytose en doden degranulatie of voor adoptieve overdracht in ontvangende muizen.

Een eenvoudige en snelle (~ 2 uur) protocol, dat een hoge opbrengst geeft Hierin beschrijven we (~ 6-12 x 10 ⁶ cellen / geïnfecteerde muis of tot 30-40 x 10 ⁶ cellen / geïnfecteerde muizen) zuiver (80 -95%) neutrofielen bij> 95% levensvatbaarheid van het beenmerg. Deze methode maakt gebruik van commercieel verkrijgbare Histopaque, die dichtheidsgradiënt cel separantsoen media bestaande uit Ficoll en natrium diatrizoaat te scheiden neutrofielen uit het beenmerg van muizen. Deze methode levert veel grotere aantallen neutrofielen per muis vergeleken met bloed of peritoneale holte, kan het worden gebruikt om neutrofielen ophalen muizen zowel steady state of na infectie, en het is gemakkelijker te laag ten opzichte van de dichtheidsgradiënt centrifugatie methode gebruikt discontinue Percoll gradiënt bestaande uit 55% / 65% / 75% Percoll in PBS ^9. Bovendien worden de tijd en de middelen om pure neutrofielen verzamelen significant verlaagd vergeleken met neutrofiel isolatie met fluorescentie-geactiveerde celsortering. Ook, omdat deze methode geen sprake van een immuno verrijkingsstap is rendabeler en vermijdt de blootstelling van cellen aan de magnetische kolom en antilichamen, wordt de kans op neutrofiel activatie afneemt.

Naast het uitvoeren van functionele studies van geïsoleerde neutrophils ex vivo en adoptieve overdracht van cellen in de ontvangende muizen, dit protocol beschrijft ook een werkwijze voor het labelen van geïsoleerde neutrofielen met verschillende CellTracker kleurstoffen. Differentiële labeling van neutrofielen van muizen van verschillende genetische achtergronden kan worden aangepast in concurrerende herbevolking studies voor het bijhouden van de overgedragen neutrofielen in de weefsels van de ontvangende muizen met behulp van flowcytometrie, die mechanistisch inzicht kan verschaffen over de directe rol van specifieke genen in de handel van neutrofielen uit het bloed in doel ontstoken organen ^6.

Protocol

1. Isolatie van beenmergcellen van de muis Euthanaseren muizen met behulp van dierlijke zorg van de instelling commissie-goedgekeurde protocol en spuit het dier oppervlak met 70% ethanol. Maak een incisie van de huid in het midden van de buik en verwijder het vel van het distale deel van de muis met inbegrip van de huid die de onderste ledematen. Afgesneden van de spieren van de onderste ledematen met een schaar en zorgvuldig ontwrichten de heupkom van het heupgewricht, terwijl het vermijd…

Representative Results

Dit protocol is geoptimaliseerd voor de oogst van beenmergcellen van muizen en de daaropvolgende afscheiding van neutrofielen uit deze cellen door dichtheidsgradiënt centrifugatie met behulp van commercieel verkrijgbaar Histopaque cel scheidingsmedium. Neutrofielen geïsoleerd met behulp van deze methode kan worden gebruikt voor een verscheidenheid van stroomafwaartse functionele studies ex vivo en adoptieve overdrachtsexperimenten in ontvangende muizen. De typische opbrengst van d…

Discussion

Hierin presenteren we een betrouwbaar, eenvoudig, snel en economisch protocol voor isolatie van grote aantallen van neutrofielen uit het beenmerg van muizen met een hoge zuiverheid en levensvatbaarheid met een dichtheidsgradiënt centrifugatie benadering. Wanneer dit protocol correct wordt uitgevoerd, kan ~ 6-12 × 10 ⁶ neutrofielen worden verhaald op een niet-geïnfecteerde muizen en maar liefst ~ 30-40 × 10 ⁶ neutrofielen kunnen worden geïsoleerd uit een muis na infectie ^6. De geïso…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
			Reagents
RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES	Cellgro	10-041-CV
Fetal Bovine Serum (Heat inactivated)	GemCell	100500
Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep)	GIBCO	15140
0.5 M EDTA	Quality Biological Inc	351-027-101
0.2% and 1.6% sodium chloride	JT Baker	3624	Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered
Sterile filtered Histopaque 1077	Sigma	10771	Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use
Sterile filtered Histopaque 1119	Sigma	11191	Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use
Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium	Cellgro	210-40-CV
Ethyl Alcohol (200 proof)	The Warner Graham Company	64-17-5
CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate)	Invitrogen	C-7025	Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C
CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine)	Invitrogen	C-2927	Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C
Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11)	eBioscience	170451-82
Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)	BD Pharmingen	551461
Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8)	BD Pharmingen	560599
Anti-mouse CD11b (Clone M1/70)	eBioscience	47-0112-82
Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Pharmingen	553141	Use at 1:100 dilution
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Molecular Probes	L-23105	Use at 1:1000 dilution
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma	67-68-5
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS	USB Corporation	19943
			Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils.
			Materials
C57BL/6 mice	Taconic
15 ml centrifuge tubes	Corning	430053
50 ml centrifuge tubes	BD Falcon	352070
25 ml serological pipettes	Celltreat	229225B
10 ml serological pipettes	Celltreat	229210B
5 ml serological pipettes	Celltreat	229205B
Pasteur pipettes (3 ml)	BD Falcon	357575
12 ml syringes	Kendall monoject	512878
25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles)	BD	305122
100 mm cell strainers	BD Falcon	352360
Bactericidal Petri dishes	BD Falcon	351029
Combitips Plus Biopur	Eppendorf	2249608-5
Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel)	Biomedical Research Instruments	10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000	Instruments sterilized prior to use
			Equipment
Tissue culture hood	The Baker Company	SG403
Refrigerated centrifuge	Thermo Fischer Scientific	75004521
37 °C shaking water bath	Thermo Fischer Scientific	3166721
			Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol.