機能研究のためのマウス骨髄好中球と養子移入実験の分離、精製とラベリング
Summary
我々は、密度勾配遠心分離によりCellTrackerと染料を用いて好中球標識のマウス骨髄からの好中球の単離および精製のためのプロトコールを述べる。これは、下流の機能研究または養子移入と追跡実験の好中球の多数を取得するための、簡易で、迅速かつ再現性のある経済的な方法を表しています。
Abstract
好中球は、自然免疫系の重要なエフェクター細胞である。彼らは急速に急性炎症のサイトで募集し、炎症環境に応じて、保護や病原性の効果を発揮している。それにもかかわらず、免疫における好中球の不可欠な役割にもかかわらず、別の感染症や炎症性の条件で好中球 'エフェクターとimmunopathogenic効果を媒介分子の要因の詳細な理解は、まだ、一部ため、その短い半減期のために、これらの取り扱いとの難しさを欠いている細胞および下流機能的研究と養子移入実験のために好中球の十分な数を取得するための信頼性のある実験プロトコルの欠如。したがって、簡単、迅速、経済的かつ信頼性のある方法は、食作用、殺、サイトカイン産生、脱顆粒及び売買などの機能を評価するためにマウスの好中球の十分な数を収穫するために非常に望ましい。そのために、我々は、高純度と生存したマウスの骨髄からの好中球の多数を分離する任意の研究室で適応させることができる再現性の密度勾配遠心分離ベースのプロトコルを提示。さらに、我々は、養子レシピエントマウスに移し、フローサイトメトリーを使用して少なくとも4時間後に転写するためのいくつかの組織で追跡することができる単離された好中球を標識するためにCellTracker染料を使用する簡単なプロトコルを提示する。このアプローチを使用して、異なるCellTracker染料、野生型および遺伝子欠損マウスからの好中球の特異的標識が正常にin vivoで標的組織への血液から好中球の輸送における特定の遺伝子の直接的な役割を評価するために競争力の再増殖試験を実行するために使用することができる。
Introduction
好中球は、ヒトにおける最も豊富な白血球です。彼らは、微生物の侵入に対する防御の最初の行としての自然免疫系との行為の主な細胞成分である。好中球の数値および/ または機能に影響を与える買収好中球減少症とプライマリ免疫不全患者では、宿主防御1でこれらの細胞の重要性を強調し、生命を脅かす侵略的な細菌や真菌感染症を開発。炎症組織2への血流から募集の好中球の走化が可能な勾配を発生させる化学誘引物質の分泌につながるオーケスト自然免疫応答の誘導においてそれらの同族パターン認識受容体の結果感染部位における侵入病原体の免疫認識。好中球は、感染部位を入力した後、彼らは、サイトカインやケモカイン産生につながる、病原体の取り込み活性化、及び酸化および非酸化を介して、私を殺してchanisms 3。先天性免疫におけるそれらのよく知られた役割に加えて、好中球はまた、最近効果的な適応免疫応答の開始剤4として重要な役割を果たすことが示されている。 5-7感染性および自己免疫疾患の様に示すように、一方、離間免疫において、保護の役割から、好中球はまた、過剰な蓄積および/ または炎症部位 において活性化に起因する組織損傷および免疫病理を媒介することができる。
いくつかの感染症や炎症状態に効果的な自然免疫応答とその多面的なエフェクター機能を搭載で好中球の不可欠な役割にもかかわらず、これらの細胞は、信頼性の高い実験プロトコルの欠如を取り扱うとの技術的な問題は、過去数十年にわたって好中球との研究を妨げている。したがって、好中球の単離のための再現可能なアッセイの使用は、好中球媒介immunoloに関する更なる研究を促進しなければならないgical機能エクスビボおよびin vivoである 。現在までに、いくつかの方法は、ヒト血液、マウス血液または骨髄8,9の密度勾配遠心分離、正または負の免疫マウスの血液または骨髄10,11から好中球を濃縮し、収穫などの好中球の単離のために記載されているチオグリコール酸または他の炎症剤12の腹腔内注射後のマウスの腹膜腔から好中球。好中球は簡単に人間の血液から大量に単離することができるが、この方法では、機能的な研究や養子移入実験13に十分な好中球の分離を排除マウス血液の限られた量のためにマウスでは次善です。腹膜腔から細胞を誘発チオグリコレートの収率は、マウスの血液に比べて大きくなるが、さらに、炎症性腹腔洗浄液中の好中球の純度の間で変化60から90パーセント、及び単離された好中球が活性化された表現型を示す。マウス腹腔12が定常状態でいくつかの好中球を有するこのように、この方法を用いて回収した細胞のみが、非刺激好中球の活性化ではなく、機能的研究を行うために使用することができる。その代わりに、骨髄は、そのような貪食、殺害や脱顆粒などの下流の機能研究のために、またはレシピエントマウスに養子移入に使用することができますどちらか刺激されていないか、または活性化された好中球11,14、大量の収穫のための便利な貯水池です。
ここで我々は、高収率を提供していますシンプルで高速な（〜2時間）プロトコルを記述（〜6-12×10 6好中球/非感染マウス、または最大30〜40×10 6好中球/感染したマウス）純粋な（80の-95％）骨髄から> 95％の生存率で好中球。この方法は、密度勾配セルSEPAある市販のHISTOPAQUEを使用配給メディアはマウスの骨髄からの好中球を分離するために、フィコールナトリウムジアトリゾエートから成る。この方法は血液または腹膜腔に比べてマウス当たりの好中球のかなり大きな数字をもたらす、それは定常状態でのまたは感染後の両方のマウスから好中球を収集するために使用することができ、それは不連続使用して密度勾配遠心法と比較して、層に容易である55％/ 65％/ PBS 9で75％パーコール成るパーコール勾配。また、純粋な好中球を収集するのに必要な時間とリソースを大幅に蛍光活性化細胞ソーティングを用いた好中球の分離に比べて減少する。また、この方法は免疫濃縮工程を必要としないので、それはより費用対効果であり、したがって、好中球活性化の可能性を減少させる、磁気カラムおよび抗体への細胞の曝露を回避する。
単離されたneutrophの機能的研究を行うことに加えてILS のex vivoとレシピエントマウスへの細胞の養子移入は、このプロトコルは異なるCellTracker染料を使用して隔離された好中球を標識するための方法についても説明します。種々の遺伝的背景のマウスからの好中球の特異的標識は、血液から好中球の輸送における特定の遺伝子の直接的な役割に機械的な洞察を提供することができ、フローサイトメトリーを使用して、レシピエントマウスの組織において転送された好中球を追跡するために競争力の再増殖試験に適合させることができるターゲットに炎症臓器6。
Protocol
Representative Results
Discussion
本明細書で我々は、密度勾配遠心分離法を用いて高純度及び生存したマウスの骨髄からの好中球、多数の単離のための信頼できる、簡単、迅速かつ経済的なプロトコルを提示する。このプロトコルが正しく実行された場合、〜6-12×10 6の好中球は、感染マウスから回収することができ、などの多く〜として30〜40×10 6好中球は、感染後6マウスから単離することができる?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、アレルギーと国立感染症研究所（NIAID）、国立衛生研究所（NIH）、米国の学内研究部門によってサポートされていました。
すべてのマウスは、アレルギーと国立感染症研究所（NIAID）での実験動物ケア認定の動物施設の認定のためのアメリカ連合に維持され、実験動物のケアと使用のためのガイドで説明する手順に従い、収容されたNIAIDの動物のケアと使用委員会によって承認されたプロトコルの後援の下に。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| RPMI 1640 1X with L-glutamine and 25 mM HEPES | Cellgro | 10-041-CV | |
| Fetal Bovine Serum (Heat inactivated) | GemCell | 100500 | |
| Penicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | |
| 0.5 M EDTA | Quality Biological Inc | 351-027-101 | |
| 0.2% and 1.6% sodium chloride | JT Baker | 3624 | Sodium chloride solutions prepared using distilled water and sterile filtered |
| Sterile filtered Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Histopaque 1077 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Sterile filtered Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Histopaque 1119 needs to be brought to 18-26 °C before use |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) without Calcium and Magnesium | Cellgro | 210-40-CV | |
| Ethyl Alcohol (200 proof) | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| CellTracker Green (CMFDA, 5-Chloromethylfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C-7025 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| CellTracker Orange (CMTMR, 5-(and 6)-4-Chloromethyl Benzoyl Amino Tetramethylrhodamine) | Invitrogen | C-2927 | Make stock solutions of 10 mM in DMSO, aliquot and store at -80 °C |
| Anti-mouse CD45 (Clone 30-F11) | eBioscience | 170451-82 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551461 | |
| Anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 560599 | |
| Anti-mouse CD11b (Clone M1/70) | eBioscience | 47-0112-82 | |
| Anti-mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Pharmingen | 553141 | Use at 1:100 dilution |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Molecular Probes | L-23105 | Use at 1:1000 dilution |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | 67-68-5 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| Table 1. Reagents for isolation, labeling and tracking of adoptively transferred neutrophils. | |||
| Materials | |||
| C57BL/6 mice | Taconic | ||
| 15 ml centrifuge tubes | Corning | 430053 | |
| 50 ml centrifuge tubes | BD Falcon | 352070 | |
| 25 ml serological pipettes | Celltreat | 229225B | |
| 10 ml serological pipettes | Celltreat | 229210B | |
| 5 ml serological pipettes | Celltreat | 229205B | |
| Pasteur pipettes (3 ml) | BD Falcon | 357575 | |
| 12 ml syringes | Kendall monoject | 512878 | |
| 25 G x 5/8 in. Needles (precision glide needles) | BD | 305122 | |
| 100 mm cell strainers | BD Falcon | 352360 | |
| Bactericidal Petri dishes | BD Falcon | 351029 | |
| Combitips Plus Biopur | Eppendorf | 2249608-5 | |
| Mouse dissecting instruments (Scissors, forceps, scalpel) | Biomedical Research Instruments | 10-2300, 10-2165, 25-1200, 26-1000 | Instruments sterilized prior to use |
| Equipment | |||
| Tissue culture hood | The Baker Company | SG403 | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 75004521 | |
| 37 °C shaking water bath | Thermo Fischer Scientific | 3166721 | |
| Table 2. List of Materials and Equipment used in this protocol. |
References
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