番茄/ GFP-FLP / FRT方法涉及在活果蝇可视化马赛克感光细胞。它可以被用来追踪在视网膜上个别光感受器细胞命运数天或数周。这种方法是理想的视网膜变性和神经退行性疾病或光感受器细胞发育的研究。
果蝇眼睛被广泛用作模型的开发和神经元变性的研究。凭借强大的有丝分裂重组技术的基础上,克隆分析典雅的遗传筛选,导致参与眼睛发育和光感受器(PR)的分化在幼虫阶段信号途径的鉴定。我们在这里描述的番茄/ GFP-FLP / FRT方法,该方法可用于在活的成年果蝇的眼睛快速克隆分析。荧光灯的光感受器细胞进行成像与角膜中和技术,对视网膜与flipase-介导的重组产生的马赛克克隆。该方法具有对视网膜的经典组织学切片的几个主要优点:它可用于高通量筛选,并已被证明是一个有效的方法,用于鉴定调节PR存活和功能的因素。它可以在相同的生活ANIM用于PR变性的动力学分析人在几个星期内,向人们展示为在成年苍蝇公关生存或特定功能基因的要求。这种方法也用于解决在发育的突变体,如那些在其中建立的平面细胞极性影响细胞自主性的问题是有用的。
果蝇视网膜是由大约800 ommatidial单元( 图1A),它被精确地组织,具有明确定义的极性的轴线( 图1B)。每个单元包含20个单元:8感光细胞(PRS)和12个辅助细胞,包括视锥细胞,色素细胞和猪鬃细胞1,2。两个班的公关来区分的视紫红质,他们表达型(RH)的基础上。六个外的PR(R1-6)表达Rh1的和被安排在一个梯形图案( 图1C)。在梯形的中心,两个内积比率(R7/R8)表示四种可能类型的视紫红质(Rh3的,RH4,RH5或RH6),组织,使得R7在于R8 3的顶部上。
2500多个基因参与了果蝇眼睛4,这已被证明是非常强大的模型的过程很宽面板,包括眼睛德韦研究的形态讲习班中,公关招聘,分化,平面细胞极性,形态,存活,凋亡和视觉传导5-9。
研究人员工作在果蝇眼睛都,多年来,开发技术成像在视网膜和开展系统性的遗传筛选。最简单的方法对图像中的成人视网膜是看角膜在一个固定的动物( 图1A)。角膜的结构,可以精确地通过扫描电子显微镜观察,并用在大规模遗传筛选由URCFG财团( http://www.bruinfly.ucla.edu )10。这是一种非常有效的方法用于可视化在角膜结构全局形态学变化,如眼睛的粗糙度或光泽度,由突变引起的常在控制基因在发育或细胞活性的早期步骤。然而,角膜全球可视化是不是sufficient识别调节公关rhabdomere形态或者成人公关活力和功能的因素。这种分析需要进行更彻底的调查,公关诚信的基础上,视网膜11-13切半薄树脂切片相衬显微镜。此技术适用于镶嵌的分析,其中突变体的PR可以通过其缺乏红色素14,15来识别。
花叶突变体克隆,也可以显现在蛹或成年视网膜的整个贴装夹层,其缺少绿色荧光蛋白(GFP)的信号上荧光显微镜16,17的基础上。这两种技术是非常有用的,但两者都是劳力和费时,因此不适合大规模筛选。我们和其他人已经开发利用的角膜中和技术生产的PR荧光蛋白18,19的成像,便于快速公关分析。利用这种技术,突变体克隆可识别的红色(W +)颜料在镶嵌成年果蝇克隆的自体荧光的基础上。然而,这种方法不提供解决细胞自主性所需要的单细胞分辨率问题19。我们通过开发番茄/ GFP-FLP / FRT方法,它结合了荧光蛋白的角膜中和与有丝分裂重组20的成像克服了这个问题。这种方法允许高通量,快速和准确地识别突变体的PR在镶嵌克隆,在单细胞分辨率( http://www.ens-lyon.fr/LBMC/ApoDrosoDatabase/ )。它适用于在动力学分析使用,对于居住在果蝇以下个人永久居民在一个星期内。我们在这里描述的番茄/ GFP-FLP / FRT方法和技巧及其在镶嵌的眼睛简单,动力学分析使用。
果蝇眼睛已被广泛用于破译的信号转导途径调节发育,增殖和存活。在90年代初期,大量的遗传筛选的进行,以确定在公关发展25-27的初始阶段所需要的途径。遗传筛选的效率是由有丝分裂重组技术,这使得它可以在镶嵌克隆21测试功能丧失的突变大大增加。因此,胚胎致死突变的作用,可以在系统中苍蝇的眼睛纯合突变克隆是杂合子,否则测试。大多数马赛克放映都集中在早期公关招聘,分化,轴突投射或在发展中的幼虫或蛹10,25-31发生形态。迄今为止,只有一个拼接屏已经研究了调节成年公关功能的机制,透过electroretin监控视觉反应ogram录音32。与番茄/ GFP-FLP / FRT和方法在活突变的动物进行时间过程分析的可能性,我们设计了用于识别调节成年PR可行性的因素的新方法和功能20,24。
番茄/ GFP-FLP / FRT方法比树脂包埋眼中的经典组织学切片几大优势。首先,这种方法是更快,更便宜和更容易比组织学方法来执行,只要配备适当的水浸渍客观荧光显微镜是可用的( 见表试剂和设备 )。其次,番茄/ GFP-FLP / FRT方法可以与转基因表达结合使用,如P的表达式(UAS,W +),携带一个微型白色转基因。相反,组织切片,其中W +是用于克隆的检测,在番茄/ GFP-FLP / FRT系统,P(UAS,瓦特+)不与克隆ð干扰etection基于番茄荧光蛋白。使用P(UAS-FATP,W +)转基因果蝇,我们能够以可视化的FATP突变的PR救援( 图7)。第三,所有类型的克隆分析,包括基于番茄/ GFP-FLP / FRT,是失去永久居民的基因型的模糊性的一个重要缺陷。事实上,它可能是不清楚的一个PR是否是因为或者由于细胞非自主的效果,特别是在突变克隆的边界缺乏特定基因的功能缺失。番茄/ GFP-FLP / FRT方法通过使得可以遵循野生型和突变体的PR在同一动物在数周期间得到解决这个问题对于变性。我们能够遵循的动力学个人收受的命运分析不同FATP突变果蝇上( 图6)。相同的克隆可以在给定的动物在不同的时间被识别的周围野生型克隆的精确形状。我们能够清晰展示LY所有丢失的PR是突变的FATP,表明FATP突变体中的PR的作用是细胞自主性。因此,通过监测的PRs在动力学分析的损失,因此能够确定的PRs中的成人发病变性模型的基因型。最后,将番茄/ GFP-FLP / FRT方法已经被证明是非常强大的用于调节因子建立的PCP 20的识别。中进球了大量的马赛克小眼的极性表型,而不需要部分的可能性,有利于快速测定的公关要求建立的PCP。尽管如此,公关完整性精细分析需要传统切片后相衬或电子显微术。
总之,番茄/ GFP-FLP / FRT方法开辟了高效的马赛克筛选新的可能性,以确定调节因子的PR发育过程和成年PR的功能,如在相UAL响应和可行性。
The authors have nothing to disclose.
该UMS3444生物科学,里昂,法国PLATIM和Droso – 工具设施。 BM的研究是由基金会拨款支持的倒拉RECHERCHEMédicale来自法国国家科学研究中心(ATIP)和ANR-12-BSV1-0019-01。帕金森病是由视网膜法国协会和里昂高等师范学院(法国)的支持。 CL是由La法甲国立CONTRE乐癌症协会的支持。
Reagent | |||
Agarose | Euromedex | D5-E | Regular agarose is used to immobilize the flies |
Petri dish | BD Falcon | 353001 | 35 x 10 mm, 1.37 x 0.39 inch |
Cold-ice water | To maintain the flies anesthetized | ||
[HEADER] | |||
Equipment | |||
Dissecting microscope | Dutcher | SMZ645 | |
Water Bath | Julabo | 9550102 | To keep the agarose solution at warm temperature |
40X Water objective | Zeiss | 420967-9900-000 | Water dipping objective for the confocal microscope |