El método de tomate / GFP-FLP / FRT implica la visualización de las células fotorreceptoras de mosaico en Drosophila que viven. Se puede utilizar para seguir destinos celulares de los fotorreceptores individuales en la retina durante días o semanas. Este método es ideal para los estudios de degeneración de la retina y enfermedades neurodegenerativas o el desarrollo de las células fotorreceptoras.
El ojo de Drosophila se utiliza ampliamente como un modelo para estudios de desarrollo y la degeneración neuronal. Con la potente técnica de recombinación mitótica, elegantes pantallas genéticos basados en el análisis clonal han llevado a la identificación de las vías de señalización implicadas en el desarrollo del ojo y de los fotorreceptores (PR) la diferenciación en las fases larvarias. Se describe aquí el método de tomate / GFP-FLP / FRT, que puede ser usado para una rápida análisis clonal en el ojo de vida adultos de Drosophila. Células fotorreceptoras fluorescentes son imágenes con la técnica de neutralización córnea, en las retinas con clones de mosaico generados por recombinación mediada por flipasa. Este método tiene varias ventajas importantes sobre seccionamiento histológico clásico de la retina: que puede ser utilizado para la selección de alto rendimiento y ha demostrado ser un método eficaz para la identificación de los factores que regulan la supervivencia y la función de PR. Puede ser utilizado para los análisis cinéticos de PR degeneración en la misma anim de estarAl lo largo de varias semanas, para demostrar el requisito de genes específicos para la supervivencia o la función de PR en la mosca adulta. Este método también es útil para abordar los aspectos de autonomía de células mutantes en desarrollo, tales como aquellos en los que se ve afectado el establecimiento de la polaridad celular plana.
La retina Drosophila se compone de cerca de 800 unidades ommatidial (Figura 1A), que se organizan con precisión, con un eje claramente definido de polaridad (Figura 1B). Cada unidad contiene 20 celdas: ocho células fotorreceptoras (RP) y 12 células accesorias, incluyendo las células de cono, las células de pigmento y células de cerdas 1,2. Dos clases de PR se distinguen sobre la base del tipo de la rodopsina (Rh) que expresan. Los seis RP exteriores (R1-6) expresan Th1 y están dispuestas en un patrón de trapecio (Figura 1C). En el centro del trapecio, los dos RP interiores (R7/R8) expresan cuatro tipos posibles de la rodopsina (RH3, RH4, Rh5 o RH6) y están organizados de tal manera que R7 se encuentra en la parte superior del R8 3.
Más de 2.500 genes están implicados en la morfogénesis del ojo de Drosophila 4, que ha demostrado ser un modelo muy potente para el estudio de un amplio grupo de procesos, incluyendo deve ojorrollo, PR reclutamiento, la diferenciación, la polaridad celular planar, la morfogénesis, la supervivencia, la apoptosis y la transducción visual 5-9.
Los investigadores que trabajan en el ojo de Drosophila han, durante muchos años, desarrolló técnicas para obtener imágenes de la retina y la realización de cribados genéticos sistemáticos. La forma más fácil de la imagen de la retina adulta es mirar a la córnea en un animal inmovilizado (Figura 1A). La estructura de la córnea se puede visualizar con precisión por microscopía electrónica de barrido y se utilizó en una pantalla genética a gran escala por el consorcio URCFG ( http://www.bruinfly.ucla.edu ) 10. Este es un enfoque muy eficaz para la visualización de los cambios globales morfológicos en la estructura de la córnea, tales como la rugosidad de ojo o brillo, a menudo inducidos por mutaciones en los genes que controlan los primeros pasos en el desarrollo o la viabilidad celular. Sin embargo, la visualización global de la córnea no es dofficient para identificar los factores que regulan la morfogénesis rhabdomere PR o PR para adultos viabilidad y función. Estos análisis requieren una investigación más a fondo de la integridad de relaciones públicas, basado en la microscopía de contraste de fase de secciones tangenciales resina semi-delgadas de la retina 11-13. Esta técnica es adecuada para análisis de mosaico, en la que los RP mutantes se pueden identificar por su falta de 14,15 pigmento rojo.
Clones mutantes mosaico también pueden ser visualizados en las disecciones de todo el montaje de la pupa o adulto retina, sobre la base de la falta de la proteína verde fluorescente de la señal (GFP) en la microscopía de fluorescencia 16,17. Estas dos técnicas son muy útiles, pero ambos son mano de obra y consume mucho tiempo y por lo tanto no son adecuados para el cribado a gran escala. Nosotros y otros han desarrollado el uso de técnicas de neutralización córnea para la obtención de imágenes de los RP que producen proteínas fluorescentes 18,19, para facilitar el análisis de PR rápida. Con esta técnica, mutantelos clones se pueden identificar sobre la base de la autofluorescencia del pigmento rojo (w +) en mosaico adultos clones de Drosophila. Sin embargo, este método no proporciona la resolución de una sola célula requerido para hacer frente a la autonomía de células emite 19. Hemos superado este problema mediante el desarrollo del método de tomate / GFP-FLP / FRT, que combina la proyección de imagen de las proteínas fluorescentes por neutralización córnea con la recombinación mitótica 20. Este método permite que el alto rendimiento, la identificación rápida y precisa de los RP mutantes en los clones en mosaico, con una resolución de una sola célula ( http://www.ens-lyon.fr/LBMC/ApoDrosoDatabase/ ). Es adecuado para su uso en los análisis cinéticos, para la siguiente RP individuales durante un período de semanas en Drosophila vivir. Se describe aquí el método de tomate / GFP-FLP / FRT y consejos para su uso en los análisis simples y cinéticos de los ojos de mosaico.
El ojo de Drosophila ha sido ampliamente utilizado para descifrar las vías de señalización que regulan el desarrollo, la proliferación y la supervivencia. A principios de 1990, se llevaron a cabo un gran número de pantallas genéticos para identificar los caminos necesarios durante las fases iniciales del desarrollo de PR 25-27. La eficiencia de pantallas genéticos se incrementó en gran medida por la técnica de recombinación mitótica, que hace que sea posible para probar mutaciones de pérdida de función en los clones de mosaico 21. Por lo tanto, el papel de las mutaciones letales embrionarias podría ser probado sistemáticamente en los clones mutantes homocigotos en los ojos de moscas que eran heterocigotos de otro modo. La mayoría de las pruebas de detección de mosaico se han centrado en el RP reclutamiento temprano, la diferenciación, la proyección axonal o la morfogénesis que ocurre en el desarrollo de larvas o pupas 10,25-31. Hasta la fecha, sólo una pantalla de mosaico ha investigado los mecanismos que regulan la función de relaciones públicas de adultos, mediante el control de la respuesta visual a través electroretinogram recordings 32. Con el método de tomate / GFP-FLP / FRT y la posibilidad de realizar análisis de evolución en el tiempo en que viven los animales mutantes, hemos diseñado un nuevo método para la identificación de los factores que regulan adulto PR viabilidad y funcionar 20,24.
El método de tomate / GFP-FLP / FRT tiene varias ventajas importantes sobre el seccionamiento histológico clásico de ojos incrustados de resina. En primer lugar, este método es mucho más rápido, más barato y más fácil de realizar que el método histológico, siempre que un microscopio de fluorescencia equipado con un objetivo de inmersión en agua apropiado está disponible (consulte la Tabla de reactivos y equipos). En segundo lugar, el método de tomate / GFP-FLP / FRT puede ser utilizado en conjunción con la expresión del transgen, tales como la expresión de P (UAS, w +), que lleva un transgén de mini-blanco. En contraste con las secciones histológicas, en la que w + se utiliza para la detección clonal, en el sistema de tomate / GFP-FLP / FRT, P (UAS, w +) no interfiere con D clonaletection basado en proteína fluorescente de tomate. El uso de P (UAS-FATP, w +) moscas transgénicas, hemos sido capaces de visualizar el rescate de los RP mutantes FATP (Figura 7). En tercer lugar, una trampa clave de todos los tipos de análisis clonal, incluyendo la basada en tomate / GFP-FLP / FRT, es la ambigüedad del genotipo de los RP perdidos. De hecho, puede no estar claro si un PR está ausente debido a la falta de una función de gen específico o debido a un efecto no autónomo de células, en particular en la frontera del clon mutante. El método de tomate / GFP-FLP / FRT evita este problema de la degeneración de lo que es posible seguir de tipo salvaje y mutantes RP en el mismo animal durante periodos de varias semanas. Hemos sido capaces de seguir el destino de los RP individuales por cinética análisis sobre diferentes FATP moscas mutantes (Figura 6). El mismo clon se puede reconocer en un animal dado en momentos diferentes, debido a la forma precisa de los alrededores de los clones de tipo salvaje. Hemos sido capaces de demostrar sin ambigüedadesmente que todos los RP que faltan eran mutantes para FATP, lo que indica que la función de los mutantes FATP en RP es autónomo de la célula. Por lo tanto, mediante el control de la pérdida de RP en un análisis cinético, es posible determinar el genotipo de los RP en modelos de degeneración de inicio adulto. Finalmente, el método de tomate / GFP-FLP / FRT ha demostrado ser muy eficaz para la identificación de los factores que regulan el establecimiento de PCP 20. La posibilidad de marcar un gran número de omatidios mosaico para un fenotipo polaridad y sin la necesidad de secciones, facilita la rápida determinación de la PR requisito para el establecimiento de la PCP. Sin embargo, análisis más fino de la integridad PR requeriría seccionamiento tradicional seguido de contraste de fase o microscopías electrónicas.
En conclusión, el método de tomate / GFP-FLP / FRT abre nuevas posibilidades para la detección de mosaico eficiente para identificar los factores que regulan los procesos de desarrollo de relaciones públicas y funciones de relaciones públicas para adultos, tales como la relaciónrespuesta ual y viabilidad.
The authors have nothing to disclose.
PLATIM y Droso-Tools instalaciones del UMS3444 Biosciences, Lyon, Francia. La investigación del BM fue apoyado por becas de la Fundación pour la Recherche Medicale del CNRS (ATIP) y la ANR-12-BSV1-0019-01. PD fue apoyada por Retina Francia asociación y la Escuela Normal Superior de Lyon (Francia). CL fue apoyada por La Ligue Nationale contre le Cancer Association.
Reagent | |||
Agarose | Euromedex | D5-E | Regular agarose is used to immobilize the flies |
Petri dish | BD Falcon | 353001 | 35 x 10 mm, 1.37 x 0.39 inch |
Cold-ice water | To maintain the flies anesthetized | ||
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Equipment | |||
Dissecting microscope | Dutcher | SMZ645 | |
Water Bath | Julabo | 9550102 | To keep the agarose solution at warm temperature |
40X Water objective | Zeiss | 420967-9900-000 | Water dipping objective for the confocal microscope |