Kwantitatieve en tijdelijke controle van zuurstof Micromilieu bij de Single Islet niveau
Summary
Microfluidic oxygen control confers more than just convenience and speed over hypoxic chambers for biological experiments. Especially when implemented via diffusion through a membrane, microfluidic oxygen can provide simultaneous liquid and gas phase modulations at the microscale-level. This technique enables dynamic multi-parametric experiments critical for studying islet pathophysiology.
Abstract
Gelijktijdige zuurstof en controle van de glucose stimulus-secretie koppeling factoren in een enkele techniek is van cruciaal belang voor het modelleren van pathofysiologische staten van eilandje hypoxie, vooral bij transplantatiepatiënten omgevingen. Standaard hypoxische kamer technieken kunnen niet beide stimulaties moduleren tegelijkertijd noch bieden real-time monitoring van glucose stimulus-secretie koppeling factoren. Om deze problemen aan te pakken, pasten wij een meerlagig microfluïdische techniek om zowel waterige als gasfase modulaties integreren via een diffusiemembraan. Dit zorgt voor een stimulatie sandwich rond de microscaled eilandjes binnen de transparante polydimethylsiloxaan (PDMS) apparaat, waardoor monitoring van de genoemde koppeling factoren via fluorescentie microscopie. Bovendien is de gasinvoer gecontroleerd door een paar microdispensers, die kwantitatieve sub minuten modulaties zuurstof tussen 0-21%. Deze intermitterende hypoxie wordt toegepast op een nieuw fenomeen eiland onderzoekent preconditionering. Bovendien, gewapend met multimodale microscopie, waren we in staat om te kijken naar gedetailleerde calcium en K ATP-kanaal dynamiek tijdens deze hypoxie. We zien microfluïdische hypoxie, vooral deze simultane dual fase techniek, als een waardevol instrument bij het bestuderen eilandjes evenals vele ex vivo weefsels.
Introduction
Dynamische hypoxie is belangrijk in de biologie, specifiek voor transplantaties
Dynamische hypoxie is een belangrijke fysiologische en pathofysiologische parameter in vele biologische weefsels. Wijziging zuurstof, bijvoorbeeld een krachtige ontwikkeling signaal in angiogenese. Bovendien, ruimtelijke en temporele patronen in hypoxie moduleren HIF1-alfa en rollen in ziekten zoals pancreaskanker. Hypoxie is ook een verstorende factor die van invloed eilandje transplantatie uitkomsten. Onlangs, tijdelijk oscillaties van hypoxie, of intermitterende hypoxie (IH) hebben aangetoond voordelen in "conditioneringscycli" eilandjes 1. Echter, zowel statische als voorbijgaande hypoxie effecten op eilandje fysiologie moeten nog goed worden begrepen of bestudeerd, voornamelijk te wijten aan het ontbreken van passende hulpmiddelen voor micro eilandje te besturen.
Eilandjes zijn goed gevasculariseerd in vivo
Alvleesklier eilandjes zijn 50-400 56, m bolvormige aggregaten van endocrine cellen, waaronder beta-cellen en alfa-cellen die verantwoordelijk zijn voor glucose homeostase zijn. Wanneer eilandjes worden blootgesteld aan stimulerende glucose in het bloed, opname en glycolyse leidt tot ATP productie, die ATP-gevoelige kaliumkanaal (KATP) kanalen en resulteert in calcium influx dat de exocytose van insuline korrels triggers opent. Zuurstof is belangrijk om dit zwaar stofwisseling rijden en insuline secretie significant beïnvloed door de dynamiek van de bloedstroom en zuurstof naast glucose gradiënten. Eilandjes Dit glucose-insulinerespons gemakkelijk uitvoeren vivo ze zijn zeer geperfundeerd in de alvleesklier, ieder binnen een cel lengte van een capillair vat. Echter, de dicht netwerk van capillairen intraislet verwijderd door collagenase gedurende eilandje isolatie 2,3. Bijgevolg worden zowel zuurstof en voedingsstoffen levert beperkt tot een 100 urn omtrek door diffusie beperkingen.
stap "> De huidige technieken hebben beperkt succes in het herscheppen van eilandje micromilieuInheemse zuurstof en glucose dynamiek, de sleutel tot het modelleren van fysiologische en pathofysiologische omstandigheden recreëren eilandje is, is moeilijk te bereiken met standaard hypoxische kamers die uitgebreide stroom nodig hebben en gebrek aan continue monitoring van eilandje functies. Bovendien transplantatie therapie voor type I diabetes geïsoleerde eilandjes blootstellen aan hypoxie in het hepatische portaalsysteem 4 die veel lager pO 2 (<2%, 5-15 mmHg) heeft vergeleken met fysiologische pancreas (5.6%, 40 mmHg). Na de transplantatie, het eilandje enten neem twee weken of meer te gerevasculariseerd. Het is aangetoond dat hypoxische blootstelling schaadt glucose-insuline koppelingsmechanisme eilandje's. Onder de stimulus-secretie koppeling factoren, calcium signalering, mitochondriale potentials, en insuline kinetiek kan gemakkelijk worden gecontroleerd met behulp van microfluidics. Onze vorige microfluïdische techniek gedemonstreerd deze real-time monitoring met nauwkeurige modulatie van de waterige micro-omgeving rond enkele eilandje 5,6. Echter, kwantificering van hypoxische bijzondere eilandje wordt gehinderd door het ontbreken van gelijktijdige stimulatie en controle technieken. Daarom combineren microfluïdische controle van zuurstof en eilandje monitoring kan eilandje hypoxie studies te verbeteren.
Microfluidics kan recreëren en moduleren de waterige en zuurstof micromilieu
De standaardtechniek voor weefsel-kweek en hypoxie is gebaseerd op hypoxische kamers. In het algemeen, de hypoxische kamers bieden enkele zuurstofconcentraties met verevening keer in ~ 10-30 min, onverenigbaar met minuten opgeschaald dynamische hypoxie. Twee recente studies gebruikten kleine aangepaste kamers voor intermitterende hypoxie blootstelling op de hele muizen, met tegenstrijdige resultaten op glucose geïnduceerde insuline respons 7,8. Houd in gedachten dat op het gehele dier niveau, de ingeademde zuurstof niet direct trangepland om capillaire eilandje pO 2, als gevolg van controles in de luchtwegen. Bovendien hebben deze studies niet gestandaardiseerd zuurstofgehalte, noch hebben zij real-time maatregelen op het weefsel niveau van de eilandjes.
Aan de andere kant, kan zuurstof microfluidics deze beperkingen overtreffen door het beheersen van zuurstof via gas kanaal netwerken. Bovendien microfluidics is compatibel met live-imaging tijdens zuurstof modulatie, een prestatie moment niet mogelijk met standaard hypoxische kamers. Een aantal van deze nieuwe microfluidics benadert gebruik maken van de gas-doorlaatbaarheid van polydimethylsiloxane aan zuurstofconcentraties lossen in microkanalen die media stromen over doelcellen 9-14. Deze apparaten zijn ook geïntegreerd meerdere discrete zuurstofconcentraties, fluorescentie gebaseerde zuurstof sensoren, en zelfs chemisch zuurstof generatie on-chip.
Liquid-solvation gebaseerd microfluidics hebben een harde tijd het behoud van stabiele, continue gradiënten zoals ikt afhankelijk convectief mengen dat gevoelig is stromingsomstandigheden. Ter vergelijking: de techniek die we hier gebruiken richt zich op het verminderen van de verspreiding pad van zuurstof levering. Het gas solvatie en afschuifstroming worden geëlimineerd door direct te diffunderen zuurstof door een membraan bezaaid met cellen of weefsels eilandje. Dit verwijdert de extra microfluidics nodig om solvatie controle en voorkomt onnodige shear stress op de eilandjes, die zelf de afgifte van insuline kan leiden. Dit platform is gebruikt om reactieve zuurstof species (ROS) tonen opregulatie zowel hyperoxic en hypoxische extremen (2-97% O 2) in celkweek 1,15. Vanwege de directe levering van zuurstof en de verwijdering van schuifstroom onze-diffusie ondersteunde platform de optimale microfluïdische oplossing voor het bestuderen eilandje hypoxie.
Multimodaal stimulatie en monitoring
-Diffusie ondersteunde microfluidics brengt ook extra voordelen wanneer aangepast voor het bestuderen eilandje microphysiology. Door een membraan als een diffusiebarrière, kan de vloeistof worden geïsoleerd van de zuurstof modulaties, zodat controles waterige glucose stimulations onafhankelijk van hypoxische stimulaties. Dit creëert een sandwich-achtige simultane stimulatie die ruimtelijk pin-punten levering aan de eilandjes. Bovendien, als het gas wordt tijdelijk gemoduleerd via geautomatiseerde microinjectors, kunnen we de zuurstofconcentratie moduleren 21-0% digitaal met voorbijgaande tijd minder dan 60 sec. De dynamische elementen van zuurstof en glucose micromilieu in de microscoop mogelijk een real-time multimodale protocol dat onmogelijk of buitengewoon omslachtig zou zijn met standaard hypoxische kamers. Met behulp van dit apparaat, werden calcium signalering (Fura-AM), mitochondriale potentials (Rhodamine 123), en insuline kinetiek (ELISA) gecontroleerd om een compleet beeld van de dynamische glucose-insuline respons onder hypoxie bieden.
Protocol
Representative Results
Discussion
The multiple modalities integrated in this islet hypoxia technique present several points noted here for troubleshooting. First the isolated islets continue to degrade and disintegrate in culture due to digestive enzymes from acinar cells. Standardizing experiments to 1-2 days after islet isolation is thus critical in obtaining consistent results. Second, the aqueous flow was stopped during hypoxia and intermittent hypoxia to prevent convective clearance at the boundary between laminar flow and diffusion. This seems to l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the National Institutes of Health Grants R01 DK091526 (JO), NSF 0852416(DTE), and Chicago Diabetes Project.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Spinner | Laurell | WS-400 | |
| SU8 | MicroChem | SU8-2150/SU8-2100 | |
| Digital Hotplate | PMC Dataplate | 722A | |
| UV Curing Lamp | OmniCure | S1000 | |
| PMDS | Dow Chemical | Sylgard 184 | |
| Corona Wand | ETP | BD-20AC | |
| Vacuum Chamber | Bel-Art | 420220000 | |
| Microdispensers | The Lee Company | IKTX0322000A | |
| 5 V and 20 V DC Power | Radio Shack | ||
| NI USB | National Instrument | NI USB-6501 | |
| Thermometer | Omega Engineering, Inc. | ||
| Peristaltic Pump | Gilson | Minipulse 2 | |
| Oxygen Sensor | Ocean Optics | NeoFox | |
| Fraction Collector | Gilson | 203 | |
| Pippette | Fisher Scientific | Finnpipette II 100μl | |
| Inverted Epifluorescence Microscope | Leica | DMI 4000B | |
| 50 ml Conical Tubes | Fisher Scientific | ||
| Fura-2 Fluorescence Dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Rhodamine 123 Fluorescence Dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Culture Media | Sigma-Aldrich | RPMI-1640 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | ||
| Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| 30 in Silicone Tubings | Cole-Parmer | 1/16 in x 1/8 in | |
| 1.5 ml Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | ||
| Y-connectors | Cole-Parmer | 1/16 in and 4 mm | |
| Syringe Connectors | Cole-Parmer | female Luer plug 1/16 in | |
| Straight Connectors | Cole-Parmer | 1/16 in | |
| Elbow Connector | Cole-Parmer | 1/16 in |
References
- Lo, J. F., Wang, Y., et al. Islet Preconditioning via Multimodal Microfluidic Modulation of Intermittent Hypoxia. Anal. Chem. 84 (4), 1987-1993 (2012).
- Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue. J. Vis. Exp.. , e1125 (2009).
- Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets. J. Vis. Exp.. , e1343 (2009).
- Shapiro, A. M., et al. Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen. N. Engl. J. Med. 343 (4), 230-238 (2000).
- Adewola, A. F., Wang, Y., Harvat, T., Eddington, D. T., Lee, D., Oberholzer, J. A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device. J. Vis. Exp.. , e1649 (2010).
- Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets. Lab Chip. 9, 97-106 (2009).
- Carreras, A., Kayali, F., Zhang, J., Hirotsu, C., Wang, Y., Gozal, D. Metabolic Effects Of Intermittent Hypoxia In Mice: Steady Versus High Frequency Applied Hypoxia Daily During The Rest Period. AJP – Regu Physiol. 303 (7), 700-709 (2012).
- Lee, E. J., et al. Time-dependent changes in glucose and insulin regulation during intermittent hypoxia and continuous hypoxia. Eur. J. Appl. Physiol. , (2012).
- Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Anal. Chem. 78, 4291-4298 (2006).
- Lam, R. H. W., Kim, M. C., Thorsen, T. Culturing aerobic and anaerobic bacteria and mammalian cells with a microfluidic differential oxygenator. Anal. Chem. 81, 5918-5924 (2009).
- Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Levchenko, A., Groisman, A. Fine temporal control of the medium gas content and acidity and on-chip generation of series of oxygen concentrations for cell cultures. Lab Chip. 9, 1073-1084 (2009).
- Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomed. Microdev. 9 (2), 123-134 (2007).
- Vollmer, A. P., Probstein, R. F., Gilbert, R., Thorsen, T. Development of an integrated microfluidic platform for dynamic oxygen sensing and delivery in a flowing medium. Lab Chip. 5, 1059-1066 (2005).
- Chen, Y., et al. Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions. Lab Chip. 11, 3626-3633 (2011).
- Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates. Lab Chip. 10, 2394-2401 (2010).
