Количественный и временной контроль кислорода микроокружения в Единой Иле уровня
Summary
Микрофлюидных контроль кислорода дает больше, чем просто удобство и скорость в течение гипоксии камер для биологических экспериментов. Особенно, когда осуществляется путем диффузии через мембрану, Микрожидкостных кислород может обеспечить одновременное жидкости и газовой фазы модуляции на микроуровне уровне. Этот метод позволяет динамические мульти-параметрические эксперименты важны для изучения островок патофизиологии.
Abstract
Одновременное оксигенации и мониторинг глюкозы стимул-секреции факторов связи в одном техники имеет решающее значение для моделирования патофизиологические состояния островков гипоксии, особенно в трансплантации средах. Стандартные гипоксические методики камерные не может модулировать как стимуляции в то же время и не предоставляет мониторинг в реальном времени глюкозы стимул-секреции факторов связи. Для решения этих трудностей, мы применили многослойную микрофлюидных технику, чтобы интегрировать как водные и газовой фазы модуляции с помощью диффузионной мембраны. Это создает бутерброд стимуляции вокруг microscaled островков внутри прозрачного полидиметилсилоксана (PDMS) устройства, что позволяет контролировать вышеупомянутых факторов связь через флуоресцентной микроскопии. Кроме того, ввод газа регулируется с помощью пары микродиспенсерами, обеспечивая количественные, суб-минутные модуляции кислорода между 0-21%. Это прерывистый гипоксия применена к исследованию новое явление островат предварительная. Кроме того, на вооружении мультимодальных микроскопии, мы были в состоянии смотреть на подробной кальция и динамики канала К АТР в эти гипоксии событий. Мы предполагаем микрофлюидных гипоксии, особенно это одновременное технику двойного фазы, как ценный инструмент в изучении островки, а также многие бывшие естественных условиях ткани.
Introduction
Динамический гипоксия играет важную роль в биологии, специально для трансплантации островковых клеток
Динамический гипоксия является важным физиологическим а также патофизиологические параметр во многих биологических тканей. Изменение кислорода, например, является мощным сигналом развития ангиогенеза. Кроме того, пространственные и временные закономерности в гипоксии модулировать HIF1-альфа и играть роли в таких болезней, как рак поджелудочной железы. Гипоксия также смешанным фактором, влияющим на островковых результаты пересадки. В последнее время во времени колебания гипоксии или прерывистой гипоксии (IH) продемонстрировали преимущества в "предварительной подготовки" островках 1. Тем не менее, как статические, так и переходные эффекты гипоксии на островок физиологии до сих пор не понятны или учились, в первую очередь из-за отсутствия соответствующих инструментов для управления микросреду островок в.
Островки хорошо васкуляризации в естественных условиях
Панкреатических островков являются 50-400 56; м сфероидальные агрегаты эндокринных клеток, в том числе бета-клеток и альфа-клеток, которые отвечают за гомеостазе глюкозы. Когда островки подвергаются стимуляции глюкозы в крови, поглощения и гликолиза приводит к продукции АТФ, что открывает АТФ-чувствительные калиевые (K ATP) каналы и результаты в притока кальция, который вызывает экзоцитоз гранул инсулина. Кислород важно управлять этим сильно метаболический процесс и секреция инсулина в значительной мере определяется динамикой кровотока и доставки кислорода в дополнение к градиентов глюкозы. Островки легко выполнить эту реакцию глюкозы к инсулину в естественных условиях, так как они очень перфузии в поджелудочной железе, каждый в пределах одной длины клеток из капиллярной судна. Тем не менее, густая сеть intraislet капилляров удаляют коллагеназы во островок изоляции 2,3. Следовательно, оба кислорода и питательных материалы ограничены к периметру 100 мкм из-за диффузионных ограничений.
шаг "> Современные методы имеют ограниченный успех в воссоздании островок микросредуРодные динамики кислорода и глюкозы воссоздания островок, ключевой для моделирования физиологических и патофизиологических условий, трудно достичь с помощью стандартных гипоксии камер, которые требуют сложного поток и не имеют постоянного мониторинга функций островков. Кроме того, трансплантации терапии для диабета типа I подвергать изолированные островки к гипоксии в печеночную воротную систему 4, который имеет значительно более низкую рО 2 (<2%, 5-15 мм рт.ст.) по сравнению с физиологическим поджелудочной железы (5,6%, 40 мм рт.ст.). Постпересадки, что трансплантаты островковых клеток взять две недели или больше, чтобы быть реваскуляризации. Было показано, что гипоксическая воздействие ухудшает глюкозо-инсулин соединительный механизм островок в. Среди стимул-секреции соединительные факторов, сигнальных кальция, митохондриальные потенциалов и инсулина кинетики может быть легко контролируется с использованием микрофлюидики. Наш предыдущий микрофлюидных техника продемонстрировала эту ремониторинга аль-время с точным модуляции водной микросреды вокруг одного островка 5,6. Однако количественная оценка гипоксического обесценение островок в тупике из-за отсутствия одновременной стимуляции и мониторинга методов. Таким образом, комбинируя микрофлюидных контроль кислорода и мониторинга островков может улучшить островковых исследования гипоксии.
Microfluidics может воссоздать и модулировать водный и кислородный микросреду
Стандартная техника для тканей и культура гипоксии исследований было основано на гипоксии камер. В общем, гипоксические камеры обеспечивают одно-концентрации кислорода со временем уравновешивания в ~ 10-30 мин, несовместимых с минутным масштабных динамической гипоксии. Два недавних исследования использовали небольшие пользовательские камеры для периодического воздействия гипоксии на всей мышей, с противоречивыми результатами по индуцированной глюкозой инсулинового ответа 7,8. Имейте в виду, что в целом уровень животного, respired кислород непосредственно не переходпланируется островок капилляр рО 2, в связи с управления в дыхательную систему. Кроме того, эти исследования не имеют стандартизированные уровни кислорода, и они не обеспечивают меры в реальном времени на тканевом уровне островков.
С другой стороны, кислород микрофлюидики может превзойти эти ограничения, контролируя кислород газа через сети каналов. Кроме того, микрофлюидики совместим с живого изображения при модуляции кислорода, подвиг в настоящий момент невозможно со стандартными гипоксии камер. Ряд этих новых микрофлюидики подходы использовать газопроницаемость полидиметилсилоксана распустить концентрации кислорода в микроканалов, которые текут качестве носителя клеток-мишеней 9-14. Эти устройства также интегрированы несколько дискретных концентрации кислорода, флуоресценция на основе кислородных датчиков, и даже химическую поколение кислорода на-чипе.
Жидкие сольватационные основе микрофлюидики иметь трудное время поддержания стабильных, непрерывные градиенты, как ят зависит от конвективного перемешивания, который чувствителен к течь условия. Для сравнения, метод мы используем здесь фокусируется на уменьшении путь диффузии доставки кислорода. Сольватация и расхода газа сдвига устраняются непосредственно диффузии кислорода через мембрану засеянного клетками или островковых тканей. Это устраняет лишние микрофлюидики необходимые для управления сольватацию и предотвращает ненужное напряжение сдвига к островков, которые само по себе может вызвать высвобождение инсулина. Эта платформа была использована для демонстрации активных форм кислорода (АФК) до регулирования в обоих гипероксических и гипоксии экстремальных значений (2-97% O 2) в клеточной культуре 1,15. Из-за прямой доставки кислорода и удаления сдвигового течения, наша диффузии-платформа обеспечивает оптимальное микрофлюидных решение для изучения островок гипоксии.
Мультимодальные стимулирование и контроль
Распространение на основе микрофлюидики также приносит дополнительные выгоды, если она адаптирована для изучения островковых миcrophysiology. При использовании мембраны в качестве диффузионного барьера, жидкость может быть выделен из кислорода модуляции, позволяя управления водного стимуляции глюкозы независимо от гипоксии стимуляции. Это создает сэндвич-как одновременное стимулирование, что пространственно пин-точек поставки в островках. Кроме того, как газ временно модулированного с помощью компьютеризированных microinjectors, можно модулировать концентрации кислорода от 21-0% цифровой с переходным время меньше, чем 60 сек. Динамические элементы управления кислорода и микросреды глюкозы в микроскоп позволяет в режиме реального времени мультимодальные протокол, который не был бы возможным или чрезвычайно громоздким, используя стандартные гипоксические камеры. С помощью этого устройства, сигнализация кальция (Фура-AM), митохондриальные потенциалов (родамина 123), и инсулина кинетика (ELISA) были проверены, чтобы обеспечить полное представление о динамических характеристик глюкозо-инсулин под гипоксии.
Protocol
Representative Results
Discussion
The multiple modalities integrated in this islet hypoxia technique present several points noted here for troubleshooting. First the isolated islets continue to degrade and disintegrate in culture due to digestive enzymes from acinar cells. Standardizing experiments to 1-2 days after islet isolation is thus critical in obtaining consistent results. Second, the aqueous flow was stopped during hypoxia and intermittent hypoxia to prevent convective clearance at the boundary between laminar flow and diffusion. This seems to l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the National Institutes of Health Grants R01 DK091526 (JO), NSF 0852416(DTE), and Chicago Diabetes Project.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Spinner | Laurell | WS-400 | |
| SU8 | MicroChem | SU8-2150/SU8-2100 | |
| Digital Hotplate | PMC Dataplate | 722A | |
| UV Curing Lamp | OmniCure | S1000 | |
| PMDS | Dow Chemical | Sylgard 184 | |
| Corona Wand | ETP | BD-20AC | |
| Vacuum Chamber | Bel-Art | 420220000 | |
| Microdispensers | The Lee Company | IKTX0322000A | |
| 5 V and 20 V DC Power | Radio Shack | ||
| NI USB | National Instrument | NI USB-6501 | |
| Thermometer | Omega Engineering, Inc. | ||
| Peristaltic Pump | Gilson | Minipulse 2 | |
| Oxygen Sensor | Ocean Optics | NeoFox | |
| Fraction Collector | Gilson | 203 | |
| Pippette | Fisher Scientific | Finnpipette II 100μl | |
| Inverted Epifluorescence Microscope | Leica | DMI 4000B | |
| 50 ml Conical Tubes | Fisher Scientific | ||
| Fura-2 Fluorescence Dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Rhodamine 123 Fluorescence Dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Culture Media | Sigma-Aldrich | RPMI-1640 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | ||
| Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| 30 in Silicone Tubings | Cole-Parmer | 1/16 in x 1/8 in | |
| 1.5 ml Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | ||
| Y-connectors | Cole-Parmer | 1/16 in and 4 mm | |
| Syringe Connectors | Cole-Parmer | female Luer plug 1/16 in | |
| Straight Connectors | Cole-Parmer | 1/16 in | |
| Elbow Connector | Cole-Parmer | 1/16 in |
References
- Lo, J. F., Wang, Y., et al. Islet Preconditioning via Multimodal Microfluidic Modulation of Intermittent Hypoxia. Anal. Chem. 84 (4), 1987-1993 (2012).
- Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue. J. Vis. Exp.. , e1125 (2009).
- Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets. J. Vis. Exp.. , e1343 (2009).
- Shapiro, A. M., et al. Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen. N. Engl. J. Med. 343 (4), 230-238 (2000).
- Adewola, A. F., Wang, Y., Harvat, T., Eddington, D. T., Lee, D., Oberholzer, J. A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device. J. Vis. Exp.. , e1649 (2010).
- Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets. Lab Chip. 9, 97-106 (2009).
- Carreras, A., Kayali, F., Zhang, J., Hirotsu, C., Wang, Y., Gozal, D. Metabolic Effects Of Intermittent Hypoxia In Mice: Steady Versus High Frequency Applied Hypoxia Daily During The Rest Period. AJP – Regu Physiol. 303 (7), 700-709 (2012).
- Lee, E. J., et al. Time-dependent changes in glucose and insulin regulation during intermittent hypoxia and continuous hypoxia. Eur. J. Appl. Physiol. , (2012).
- Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Anal. Chem. 78, 4291-4298 (2006).
- Lam, R. H. W., Kim, M. C., Thorsen, T. Culturing aerobic and anaerobic bacteria and mammalian cells with a microfluidic differential oxygenator. Anal. Chem. 81, 5918-5924 (2009).
- Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Levchenko, A., Groisman, A. Fine temporal control of the medium gas content and acidity and on-chip generation of series of oxygen concentrations for cell cultures. Lab Chip. 9, 1073-1084 (2009).
- Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomed. Microdev. 9 (2), 123-134 (2007).
- Vollmer, A. P., Probstein, R. F., Gilbert, R., Thorsen, T. Development of an integrated microfluidic platform for dynamic oxygen sensing and delivery in a flowing medium. Lab Chip. 5, 1059-1066 (2005).
- Chen, Y., et al. Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions. Lab Chip. 11, 3626-3633 (2011).
- Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates. Lab Chip. 10, 2394-2401 (2010).
