Utfodring av fästingar på djur för Transmission och Xenodiagnosis i Lyme Disease Research

Summary

Borrelia är den vanligaste rapporterade vektorburen sjukdom i Nordamerika. Den smittämnen, är Borrelia burgdorferi spirochete bakterie som överförs av ixodid fästingar. Transmission och upptäckt av infektion i djurmodeller har optimerats genom användning av fästingen utfodring, som vi beskriver här.

Abstract

Överföring av etiologiska agent för borrelia, Borrelia burgdorferi, sker genom kvarstad och blod utfodring av Ixodes arter fästingar på däggdjursvärdar. I naturen kan denna zoonotiska bakteriell patogen använda en mängd olika reservoarvärdar, men det vita på foten mus (Peromyscus leucopus) är den primära reservoaren för larver och nymphal fästingar i Nordamerika. Människor är tillfälliga värdar oftast infekterade med B. burgdorferi genom bett av fästingar i nymphal scenen. B. burgdorferi anpassar sig till sina värdar genom hela enzootisk cykeln, så möjligheten att utforska funktionerna i dessa spiroketer och deras effekter på däggdjursvärdar kräver användning av fästing utfodring. Dessutom har tekniken enligt xenodiagnosis (med hjälp av naturlig vektor för detektering och återhämtning av ett infektiöst medel) varit användbart i studier av kryptisk infektion. I syfte att erhålla nymphal fästingar som harbor B. burgdorferi,fästingar matas levande spiroketer i kultur genom kapillärrör. Två djurmodeller, möss och icke-mänskliga primater, används oftast för studier Lyme sjukdom som involverar fästing utfodring. Vi visar de metoder som dessa fästingar kan matas på, och återhämtat sig från djur för antingen infektion eller xenodiagnosis.

Introduction

Under 2011, borrelia var den 6: e vanligaste Nationellt anmälningspliktig sjukdom i Nordamerika ( http://www.cdc.gov/lyme/stats/index.html ). B. burgdorferi är en mångsidig mikrob, både genetiskt och antigent (över i ^1). Dess genetiska konstitution innehåller ett stort (> 900 kB) kromosom och upp till 21 plasmider (12 linjära, 9 cirkulära), med plasmid innehåll varierar mellan isolaten. Mycket är att lära om detta spiroket, eftersom över 90% av de plasmid öppna läsramar är kopplad till några kända bakteriella sekvenser ^2,3. B. burgdorferi presenterar en mängd olika antigener som potentiella mål för värdimmunitet. Dock kvarstår en obehandlad infektion ofta. Samspelet mellan spiroketer med fästingen miljö och vertebratvärden miljön kräver anpassning av B. burgdorferi under infektionsprocessen. Flera plasmidkodadgener som är kända för att vara differentiellt uttryckt som svar på förändringar i temperatur, pH, celltäthet och även steget av fästing livscykel ^4-8.

Studien av B. burgdorferi anpassning under hela sin enzootisk cykel, och värdsvar efter infektion med den naturliga vägen bygger på förmågan att mata fästingar på lämpliga djurmodeller. Sådana studier är uppfyllda med de tekniska utmaningar som genererar fästingar som hyser B. burgdorferi, och säkerställa en effektiv överföring och / eller matning av fästingar på modell värd. Dessutom är avgörande för inneslutning och återvinning av infekterade fästingar. Bland de modeller som används är möss och icke-mänskliga primater, som var och en fungerar som ett värdefullt verktyg i Lyme sjukdom forskning. Som med det vita på foten mus, som är en naturlig reservoar värd för B. burgdorferi, är laboratoriet musen en mycket mottaglig värd som stöder ihållande infektion med B. burgdorferi ^9. Foljande infektion av sjukdoms mottagliga möss, såsom C3H-stammen, spiroketema sprida till multipla vävnader, inklusive huden, urinblåsan, muskler, leder och hjärta. Inflammatoriska svar på infektion leda till sjuka hjärta och ledvävnad. Medan spiroketer härdar i denna värd och förbli smittsamma, kan inflammatoriska lesioner bli intermittent, inte olikt processen hos människor. Den musmodell har därmed mycket information om B. burgdorferi-inducerad patologi, inklusive artrit och kardit och värd immunsvar ^10-12. Ur patogenen har vissa gener differentiellt uttryckta under infektion däggdjurs karakteriserats, som har någon nödvändig för överföring från fästingen vektorn ^13-21.

Även om flera djurarter har använts för att studera borrelia ²² rhesusapamacaques likna närmast multiorgan karaktär mänskliga sjukdomar ^23. Till skillnad från andradjurmodeller, bredden av sjukdomsmanifestationer såsom erythema migrans, kardit, artrit och neuropati i det perifera och centrala nervsystemet observeras hos makaker. Hos möss reservoaren värd för B. burgdorferi, varierar sjukdom genom musstam och ²⁴ års ålder, medan de tidiga och sena-spridas manifestationer är ovanliga ^9. Dessutom, andra gnagare, hardjur och hundar alla misslyckas med att uppvisa neurologiska sjukdomen från B. burgdorferi infektion ^25. Viktigt makaker uppvisar tecken som är karakteristiska för alla tre faser av Lyme borrelios, nämligen tidig lokaliserad, tidig-spridas, och sena stadium borrelia ^26-28. Erythema migrans (EM) är tänkt att ske i 70-80% av mänskliga fall ^29, och ses också i rhesusmacaques ^28,30. Efter infektion, spiroketema sprider från platsen för ympning på flera organ. Spirochetal DNA har upptäckts i skelett muscles, hjärta, urinblåsan, perifer nerv och plexus, såväl som i det centrala nervsystemet (hjärnan, hjärnstammen och lillhjärnan, ryggmärg, och dura mater) ^31.

Kryssa livnär sig på möss har använts av oss och andra forskargrupper för förökning av fästingkolonier, i reservoar kompetens studerar ^32-36 och i studier av B. burgdorferi Pathogenesis ^37-40. Denna teknik har också använts för xenodiagnosis och testning av vaccineffektiviteten hos möss ^41-44. Vi har utfodras Ixodes fästingar på icke-mänskliga primater för modellutveckling ^28, en studie av vaccineffekt ^45, och för xenodiagnosis i bedömningen av uthållighet efter antibiotikabehandling ^46. Fästingar som hamn B. burgdorferi kan bibehållas i en naturlig enzootisk cykel genom att mata larver på infekterade möss och använder nymferna för studierna, eftersom de spiroketer överförs via levnadsstadier. I denna rapportVi instruerar om hur man skapar fästingar infekterade med vildtyp eller mutant B. burgdorferi, med kapillär sondmatning. Detta kan även åstadkommas genom mikroinjektion ⁴⁷ och genom nedsänkning ^48. Syftet med artificiella introduktionen av B. burgdorferi i fästingar kan vara att studera mutantstammar vars överförbarhet är okänt, för att generera en grupp av fästingar med en hög infektionsfrekvens och för att minska risken för fel genom att upprätthålla en ren och annars oinfekterade fästing koloni. Dessutom visar vi fästing som livnär sig på möss och icke-humana primater, för att säkerställa inneslutning och återvinning av fylld fästingar. Användningen av fästingen utfodring är viktigt för framtida studier av immunsvar mot B. burgdorferi infektion, potentiella Lyme vaccinets effekt, och xenodiagnosis för detektion av ockulta infektioner.

Protocol

En experimentell beskrivning av fästing ympning och utfodring på djur för Lyme sjukdomforskning visas i figur 1. 1. Ympa nymphal Ixodes Fästingar med B. burgdorferi Använda Kapillär sondmatning När du utför manipulationer med fästingar är vita rockar med elastiska ärmar, handskar och engångs bouffant mössor slitna. Vår metod är en modifierad version av den som rapporterats av Broad et al. …

Representative Results

Efter slutförandet av kapillär matning, är fästingarna normalt vilade vid 23 ° C under 2-3 veckor innan de matas på djur för sändning. Med hjälp av kapillär-matningsteknik, har vi funnit att över 90% av den matade fästingar hamnen B. burgdorferi. Andelen positiva fästingar bestäms av tvätt fästingar i peroxid och etanol, sedan krossa dem i steril PBS med ett mikrofugrör formad mortelstöt. Midgut innehållet läckt ut i PBS är fixerade på objektglas och färgas med en anti-Borrelia s…

Discussion

För att få fästingar som hamn B. burgdorferi för efterföljande studier, kan fästingarna vara: (1) matas på infekterade möss i larvstadiet, (2) nedsänkt i B. burgdorferi kulturer vid antingen larver eller nymphal etapp ^48, (3) idag injiceras med B. burgdorferi ^47, eller (4) kapillärrör matad B. burgdorferi ^49. Även om var och en av dessa metoder har sitt syfte, för att säkerställa att en stor del av de fästingar som ska användas för in…

Materials

			Reagent
BSK-H	Sigma	B-8291
Ketamine HCl
Tangle Trap coating Paste	Ladd research	T-131
SkinPrep	Allegro Medical Supplies	177364
LeFlap, 3″ x 3″	Monarch Labs
Hypafix tape	Allegro Medical Supplies	191523
SkinBond	Allegro Medical Supplies	554536
UniSolve	Allegro Medical Supplies	176640
Biatane Foam, adhesive 4″x4″	Coloplast	3420
DuoDerm CGF Dressing – 4″ x 4″, (3/4)” adhesive border	Convatec	187971
Nonhuman primate jackets with flexible 2″ back panels; add drawstrings at top and bottom	Lomir Biomedical Inc.
			EQUIPMENT
Pipet puller	David Kopf Instruments	Model 700C
Dark field microscope	Leitz Wetzlar	Dialux
Dissecting microscope	Leica	Zoom 2000
Mouse caging	Allentown caging