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Immunology and Infection

Alimentação dos Carrapatos em Animais de Transmissão e Xenodiagnóstico em Lyme Disease Research

Published: August 31, 2013 doi: 10.3791/50617
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Division of Bacteriology & Parasitology, Tulane National Primate Research Center, Tulane University Health Sciences Center

Summary

A doença de Lyme é a doença mais comumente relatados transmitidas por vetores na América do Norte. O agente causador, a Borrelia burgdorferi é uma bactéria espiroqueta transmitida por carrapatos ixodídeos. A transmissão e a detecção de infecção em modelos animais é optimizada pela utilização de alimentação de carraça, que aqui descrita.

Abstract

A transmissão do agente etiológico da doença de Lyme, Borrelia burgdorferi, ocorre pelo apego e alimentarem de sangue de espécies Ixodes carrapatos em hospedeiros mamíferos. Na natureza, este patógeno bacteriano zoonótica pode usar uma variedade de hospedeiros, mas o rato branco de pés (Peromyscus leucopus) é o reservatório primário para carrapatos larva e ninfa na América do Norte. Os seres humanos são hospedeiros acidentais mais frequentemente infectados com B. burgdorferi pela picada de carrapatos na fase de ninfa. B. burgdorferi se adapta a seus hospedeiros ao longo do ciclo enzoótica, portanto a capacidade de explorar as funções destes espiroquetas e seus efeitos em hospedeiros mamíferos requer o uso de alimentação do carrapato. Além disso, a técnica de xenodiagnóstico (utilizando o vector natural para a detecção e a recuperação de um agente infeccioso) tem sido útil em estudos de infecção críptica. Para a obtenção de ninfas carrapatos que porto B. burgdorferi,carrapatos são alimentados espiroquetas vivas em cultura por meio de tubos capilares. Dois modelos animais, ratos e primatas não-humanos, são mais comumente usados ​​para estudos de doença de Lyme que envolvem a alimentação do carrapato. Demonstramos os métodos pelos quais esses carrapatos podem ser alimentados em cima, e recuperados a partir de animais para ou infecção ou xenodiagnóstico.

Introduction

Em 2011, a doença de Lyme foi a doença mais comum Nacionalmente Notificável 6 na América do Norte ( http://www.cdc.gov/lyme/stats/index.html ). B. burgdorferi é um micróbio versátil, tanto geneticamente e antigenicamente (revisto em 1). Sua constituição genética inclui um grande (> 900 kB) cromossomo e até 21 plasmídeos (12 lineares, 9 circulares), com conteúdo plasmídeo variando entre os isolados. Muito está a ser aprendido sobre este espiroquetas, como mais de 90% dos plasmídeos de leitura aberta quadros são alheios a quaisquer conhecidas seqüências bacterianas 2,3. B. burgdorferi apresenta uma grande variedade de antigénios, como alvos potenciais de imunidade do hospedeiro. No entanto, a infecção não tratada muitas vezes persistir. A interação de espiroquetas com o meio ambiente e carrapato hospedeiro vertebrado exige uma adaptação por B. burgdorferi em todo o processo de infecção. Vários plasmídeo codificadogenes são conhecidos por serem expressos diferencialmente em resposta a mudanças de temperatura, pH, densidade celular e mesmo estágio do ciclo de vida do carrapato 4-8.

O estudo da B. burgdorferi adaptação durante todo o seu ciclo de enzoótica, e as respostas do hospedeiro após a infecção por via natural, baseia-se na capacidade de alimentar carrapatos em modelos animais apropriados. Tais estudos estão satisfeitos com os desafios técnicos de geração de carrapatos que abrigam B. burgdorferi, e garantir a transmissão eficiente e / ou alimentação de carrapatos no host modelo. Além disso, a retenção e a recuperação de carraças infectadas é essencial. Entre os modelos utilizados são ratos e primatas não-humanos, cada um dos quais serve como uma ferramenta valiosa para a pesquisa da doença de Lyme. Tal como acontece com o rato branco de pés, o que é um hospedeiro natural para B. burgdorferi, o rato de laboratório é uma série altamente suscetíveis que suporta a infecção persistente por B. burgdorferi 9. Folguinte a infecção de ratinhos susceptíveis a doenças, tais como a estirpe C3H, os espiroquetas difundir para vários tecidos, incluindo a pele, bexiga, músculos, articulações e coração. As respostas inflamatórias à infecção levar a coração doente e articulações. Enquanto as espiroquetas persistir nesse hospedeiro e permanecem infecciosos, lesões inflamatórias, pode tornar-se intermitente, ao contrário do processo em seres humanos. O modelo do rato tem, assim, fornecido muita informação sobre B. patologia induzida por burgdorferi, incluindo artrite e cardite e resposta imune do hospedeiro 10-12. Do ponto de vista do agente patogénico, certos genes diferencialmente expressos durante a infecção de mamíferos têm sido caracterizados, como ter algum necessário para a transmissão a partir do vector carrapato 13-21.

Apesar de várias espécies animais têm sido utilizados para estudar a doença de Lyme 22 macacos rhesus imitar mais de perto o caráter multi-órgão da doença humana 23. Ao contrário de outrosmodelos animais, a amplitude das manifestações de doença, tais como eritema migrans, cardite, artrite e neuropatias dos sistemas nervosos periférico e central, observada em macacos. Em camundongos, o anfitrião reservatório para B. burgdorferi, a doença varia de acordo com a tensão do mouse e 24 anos, enquanto que as manifestações precoces e tardias-divulgados são incomuns 9. Além disso, outros roedores, lagomorfos, e caninos tudo não exibem doença neurológica de B. infecção burgdorferi 25. É importante ressaltar que os macacos apresentam sinais que são característicos de todas as três fases da borreliose de Lyme, ou seja, no início localizada, early-divulgada, e fase final de doença de Lyme 26-28. Eritema migrans (EM), pensa-se que ocorre em 70-80% dos casos humanos 29, e é também observada em macacos rhesus 28,30. Após a infecção, as espiroquetas difundir a partir do local de inoculação de vários órgãos. ADN Espiroquetal foi detectada em mu esqueléticoscles, coração, bexiga, sistema nervoso periférico e do plexo, bem como no sistema nervoso central (cérebro, tronco cerebral e cerebelo, espinal medula, e dura-máter) 31.

Assinale alimentando-se de ratos tem sido utilizada por nós e por outros grupos de pesquisa para a propagação de colônias de carrapatos, em competência reservatório estuda 32-36 e em estudos de B. burgdorferi patogênese 37-40. Esta técnica também foi usada para xenodiagnóstico e testes de eficácia da vacina em ratinhos 41-44. Temos alimentado Ixodes carrapatos em primatas não-humanos para o desenvolvimento de modelo de 28 anos, um estudo sobre a eficácia da vacina de 45 anos, e por xenodiagnóstico na avaliação da persistência do tratamento pós-antibiótico 46. Carrapatos que porto B. burgdorferi podem ser mantidos em um ciclo natural, por enzoótica alimentando larvas em ratinhos infectados e usando as ninfas de estudos, como as espiroquetas são transmitidos através das etapas da vida. Neste relatório, Instruímos sobre como gerar os carrapatos infectados com o tipo selvagem ou mutante B. burgdorferi, usando capilar tubo de alimentação. Isto também pode ser realizada por micro-injecção 47 e por imersão 48. A finalidade da introdução artificial de B. burgdorferi em carraças podem ser estudar estirpes mutantes cuja transmissibilidade é desconhecido, para gerar um grupo de carraças com uma alta taxa de infecção, e para reduzir a possibilidade de erros através da manutenção de uma colónia carrapato limpo e de outra forma não infectado. Além disso, demonstramos alimentação carrapato em ratos e primatas não-humanos, de modo a assegurar a contenção e recuperação de carrapatos repletos. O uso de alimentação carrapato é essencial para futuros estudos de respostas imunes a B. infecção burgdorferi, o potencial de eficácia da vacina Lyme, e xenodiagnóstico para detecção de infecções ocultas.

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Protocol

Um esboço experimental de inoculação carrapato e alimentação aos animais para a pesquisa da doença de Lyme é mostrada na Figura 1.

1. Inoculando ninfas Ixodes Carrapatos com B. burgdorferi Usando Tubo Capilar-feeding

Ao realizar manipulações com carrapatos, jaleco branco com mangas elásticas, luvas e bonés bouffant descartáveis ​​são usados.

  1. A nossa técnica é uma versão modificada do que relatado por Broadwater et al. 49. Prepare tubos capilares através do aquecimento e puxando pipetas Pasteur de quebrar magreza usando um extrator pipeta. Utilizando uma pinça e dissecando escopo, quebrar as dicas para o diâmetro ideal (cerca de 0,2 mm). Um tubo normalizado para o tamanho carrapato mouthpart é utilizado como um guia de dimensionamento. A viseira deve ser usado na preparação das pipetas.
  2. Crescer B. burgdorferi para entre 2-8 x 10 7 / ml (fase mid-log) em meio BSK-H (Sigma) conFORMAÇÃO 6% de soro de coelho.
  3. Use carrapatos ninfa que foram armazenados a 23 ° C durante 4-6 semanas de muda pós-larval. Local carrapatos para um pequeno 60 x 15 mm placa de Petri com fita dupla-face na superfície inferior externa do prato. Coloque o ticks do lado ventral para cima.
  4. Mergulhe a ponta do tubo capilar para a B. tubo de cultura burgdorferi após a mistura. Coloque o tubo capilar sobre o hypostome das partes da boca carrapato usando um escopo de dissecação. Use argila moldagem para fixar o tubo no lugar, como mostrado na Figura 2A.
  5. Coloque as placas de Petri com carrapatos afixadas no interior uma grande banheira de plástico transparente para um nível adicional de contenção. Toalhas de papel molhadas são adicionados para fornecer umidade. Coloque as carraças em um incubador térmico de 37 ° C durante 30 min-2 h, até a defecação é aparente. Isso indica que a mídia que contém espiroquetas passou pelo carrapato.
  6. Descanse os carrapatos para 2-4 semanas a 23 ° C para permitir a adaptação ao ambiente carrapato antes da alimentaçãolos em animais.

2. Infectar ratos com B. burgdorferi por Tick

  1. Diluir estoque cetamina 1:10 em água estéril. Anestesiar cada rato com 100 mg / kg de cetamina por via intraperitoneal com uma seringa de tuberculina
  2. Uma vez que o mouse é totalmente anestesiado, raspar o rato das orelhas para o meio de volta usando uma multa (Remington suavizar e sedoso) aparador elétrico.
  3. Em uma panela branco com nenhum outro objeto próximo, transferir os carrapatos de ninfa (que porto B. burgdorferi) por um pincel umedecido para a área calva do mouse. Alternativamente, carraças infectadas pode ser colocado em ratinhos para xenodiagnóstico de ratinhos com infecção suspeito. A utilização de uma superfície limpa e branca para a colocação carrapato ajuda a assegurar que qualquer carrapatos acopladas será prontamente visto.
  4. Posicione o mouse em encarceramento especializado (Allentown Jaula, Allentown, PA). O encarceramento é constituído por uma grelha de aço inoxidável de elevada desde o fundo da gaiola. Tele topo de gaiola foi modificado pela nossa in-house oficina mecânica para elevar o suporte da garrafa de água o suficiente para permitir a livre circulação do mouse por baixo. O pan é preenchido com cerca de ½ polegada de água para prender qualquer carrapatos que caem camundongos (Figura 3A). Para minimizar o risco de hipotermia, almofadas de aquecimento reutilizáveis, microondas antes do uso, são colocados debaixo das gaiolas até ratos acordar completamente da anestesia. Os animais são muitas vezes ataxic como eles se recuperar da anestesia e esfregar contra alimentos e bandejas de água, pelo que estes devem ser removidos. O nível da água está baixo o suficiente para impedir que os membros de ratos de submersão.
  5. Coloque a gaiola dentro de uma bandeja que foi forrado com emaranhado armadilha colar (Contech, Victoria, BC, Canadá) e fita adesiva para garantir o aprisionamento de artrópodes. Os ratos são enjaulados individualmente e observados continuamente durante o período da anestesia.
  6. Dentro de 2 horas, quando os ratos são completamente acordado da anestesia, a bandeja de comida e garrafa de água são substituídos para a jaula. Após 24 horas, o enriquecimento habitacional composto por uma cabana de plástico e Nylabone é substituído.
  7. Depois de 3, 4 e 5 dias, verifique o rato, gaiola e água gaiola para carrapatos alimentados. A água gaiola é peneirado através de uma panela de metal branco (ou seja, "a extração de ouro"). Enxágüe alimentados carrapatos em água limpa e armazenar em frascos de plástico (Figura 3B). Nos dias 3 e 4, substituir a água na gaiola com água limpa. No dia 5, verificar não só a gaiola, mas o mouse completamente para carrapatos. Normalmente, neste ponto todos os carrapatos foram alimentados e os ratinhos podem ser devolvidos ao encarceramento regular.
  8. Coloque todos os resíduos das gaiolas do rato, incluindo líquidos, em recipientes de Biohazard por autoclavagem e disposição. Manter um registo do número de carraças e colocadas em ratinhos aqueles recuperados em todos os momentos.

3. Alimentando Carrapatos em Primatas não humanos para infecção por B. burgdorferi ou xenodiagnóstico

  1. Prepare o dispositivo de contenção carrapato: Corte um círculo de diâmetro de 1 ¾ polegadas no 3 polegadas x3 polegadas LeFlap (aba) utilizando um bisturi limpa e o guia de medição. Use o recorte como um modelo para cortar círculos de tamanho idêntico na espuma Biatane e Duoderm. A espuma é utilizado para elevar a aba sobre a superfície da pele e prevenir a possível esmagamento do carrapato. O Duoderm adiciona outra camada de amortecimento e cobre as bordas do dispositivo de contenção para aumentar a segurança da carraça fuga. Um diagrama do dispositivo de contenção está representado na Figura 4.
  2. Pessoal veterinário vai anestesiar o animal com 5-8 mg / kg Telazol por injecção intramuscular.
  3. Corte o pêlo do animal com aparador elétrico (Oster), equipado com tamanho de 40 lâminas. Todas as áreas que serão cobertas pelo paletó são cortados: costas, frente, braços. Usando o creme de barbear e lâminas de barbear descartáveis ​​de dupla lâmina, fazer a barba de perto uma área de aproximadamente 25 centímetros verticais x 20 cm horizontal. Limpe com papel toalha úmido e seque com fogo baixo para secar a pele.
  4. Coloque a aba na tele animais do dorso, logo abaixo da escápula, em ambos os lados da coluna vertebral. Use um marcador para traçar o círculo em que local. Prepare a área da pele ao redor do círculo, limpando-a com SkinPrep. Isso remove óleo em pele que podem afetar a adesão de dispositivos de cola e de contenção. Deixando sobre uma circunferência de 1 cm de espaço ao redor do círculo, aplique uma camada de cola de pele (SkinBond) com uma largura de a 4 cm.
  5. Retire o adesivo da espuma Biatane e apor na pele no local apropriado. Os animais são novamente anestesiados pela equipe veterinária com 5 mg / kg Telazol. Selar as bordas com cola a pele e fita Hypafix. Retire o adesivo da tampa e fixe no topo da Biatane. Colocar fita Hypafix em torno das bordas do LeFlap, em seguida, para baixo a aba de fita de malha de a aba e colocar o revestimento sobre o animal. Tape e emaranhado Armadilha pasta é aplicada para o chão em um perímetro em torno do encarceramento primata não-humano para maior segurança.
  6. Para minimizar os efeitos da chemicalals utilizados no Passo 3.4 sobre alimentação carrapato, os carrapatos são adicionados 24 horas após o dispositivo de contenção está no lugar. Neste ponto, a segurança do dispositivo é também inspeccionados e reforçado, se necessário. Tipicamente, 20 ninfas não alimentadas (molt 4-8 semanas pós-larvar) são adicionados para a pele dentro do dispositivo utilizando um pincel.
  7. Retire o adesivo da malha do retalho e selá-lo no lugar. Por último, remover o suporte Duoderm para expor adesivo, e colocar na parte superior do dispositivo de contenção. Adicionar um pedaço de fita Hypafix através do círculo de malha aberta, e substitua o casaco. O dispositivo de contenção completo é mostrado na Figura 5A.
  8. Após 5 dias, anestesiar os animais como descrito acima e os revestimentos são retirados. Retire a fita primeiro a inspecionar alimentação carrapato através da malha (Figura 5B). Retire cuidadosamente o Duoderm longe da aba.
  9. Puxe a parte de malha nas bordas para fornecer acesso aos carrapatos. Carrapatos Fed são frequentemente encontrados perto ou sobo circulo de espuma (Figura 5C) e são removidos e colocados em água limpa com um pincel. Remova o dispositivo de uma vez todos os carrapatos alimentados visíveis são coletados (Figura 5D).

Nota: Muitas vezes, o dispositivo de contenção pode simplesmente ser retirado da pele. Se a aderência for forte e pode causar danos à pele, o solvente Unisolve é aplicado à superfície para remoção suave. A pele é limpa com isopropanol e carrapatos são armazenadas a 23 ° C. Se usado para a infecção, os carrapatos podem ser esmagadas para confirmar o número que continha B. burgdorferi. Se for usado para xenodiagnóstico, os carrapatos são mantidos por 1-3 semanas antes da análise do conteúdo do intestino médio.

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Representative Results

Após a conclusão da alimentação capilar, as carraças são normalmente repousou a 23 ° C durante 2-3 semanas, antes de serem alimentados com animais para a transmissão. Usando a técnica capilar-alimentação, descobrimos que mais de 90% de que o Fed carrapatos porto B. burgdorferi. A percentagem de carrapatos positivas é determinada por lavagem carrapatos em peróxido e de etanol, em seguida, esmagando-as em PBS estéril com um pilão em forma de tubo de microcentrífuga. O conteúdo do intestino médio derramado no PBS são fixadas em lâminas e coradas com um anticorpo anti-espécie Borrelia que é FITC-conjugada. Representativos esfregaços carrapato do intestino médio visualizadas por microscopia de fluorescência são representados na figura 2B-C

As taxas de infecção do rato com baixa passagem tensão B31 tipo selvagem B. burgdorferi estão perto de 100%. Uma combinação de sorologia e cultura de B. burgdorferi a partir de tecidos de rato é usado para determinar se cada rato tornou-se infectado. Um showi western blotng respostas de anticorpos do soro de ratinhos infectados com B. burgdorferi pelo carrapato é mostrado na Figura 3C. Esta técnica tem sido utilizada para estudar a transmissibilidade e infectividade de B. mutante burgdorferi cepas 37-39.

Temos usado alimentação carrapato em primatas não-humanos de infecção e para xenodiagnóstico. Esforços têm sido feitos para melhorar a alimentação carrapato e recuperação de carrapatos totalmente alimentados através da aplicação do dispositivo de contenção aba. O produto aba é usada para aplicação de larvas medicinais em seres humanos, mas temos modificado para carrapato alimentando-se de primatas. Em estudos anteriores, utilizamos uma cápsula por carrapato contenção 27,28,45,46 e obteve uma taxa média de alimentação (# alimentado carrapatos / # carrapatos adicionado ao cápsulas) de 35,2%, variando entre 23,5-52,5%. Em estudos de infecção, as taxas de transmissão (# animais infectados / # alimentado em cima) em média 86,5%. Em experimentos mais recentes, as taxas de alimentação utilizando LeFlap ter sido entre 50-90%. Em raras ocasiões, usando o método anterior, os carrapatos se arrastou sob a cápsula e na fita adesiva, onde se desidratar e morrer. Usando a aba a melhoria da alimentação e múltiplas camadas de adesivo mantiveram os carrapatos contidos.

Além de coloração fluorescente directa de carrapato preparação intestino (Figura 2B-C), os métodos mais sensíveis podem ser usadas para detectar B. burgdorferi dentro de carrapatos. A detecção molecular pode, e tem sido utilizada para detectar B. específicas de DNA burgdorferi 42,50,51 com PCR padrão ou quantitativa. Alvos comuns para detecção são a flacidez 46,50, OspC 46 e OspA 42,51 genes. A viabilidade de espiroquetas recuperados também foi examinado pela cultura dos preparativos do intestino médio e xenodiagnóstico alimentação carrapatos em camundongos ingênuos 42.

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Figura 1. Alimentando carrapatos em animais para a transmissão de Borrelia burgdorferi. Esquema geral das técnicas envolvidas na alimentação de carrapatos em animais para estudos de doença de Lyme. Carrapatos são culturas alimentadas com tubo capilar de B. burgdorferi e pode ser alimentado em modelos animais da doença de Lyme, como ratos e primatas não-humanos (macacos rhesus). Clique aqui para ver maior figura .

Figura 2
Figura 2. O método do tubo-alimentação capilar e resultados. A) O aparelho usado para alimentar os carrapatos no mostrado, com uma visão ampliada do tubo de carrapato e capilar no lado direito. AC) imagens representativas dos intestino médio de carrapatos alimentados B. burgdorferi. sme O intestino médioars foram coradas com espécies-FITC anticorpos policlonais anti-Borrelia (Kirkegaard & Perry Labs) e visualizados em microscópio fluorescente.

Figura 3
Figura 3. Ixodes scapularis carrapato alimentando-se de ratos de laboratório. A) O encarceramento especializado para ratos quando utilizado para a alimentação do carrapato. O chão de arame é elevado acima de uma panela de água para coletar carrapatos. Um rato anestesiado é mostrado na imagem à direita. B) Os recipientes de armazenamento usados ​​para carrapatos. C) immunoblots representativos de camundongos infectados por carrapatos. O soro do dia 21 pós-infecção foi usado para sondar manchas contendo B. burgdorferi e lisados ​​de proteína OspC recombinante, um antigénio imunodominante.

Figura 4
Figura 4. Diagrama do dispositivo de contenção carrapato utilizado para alimentação de carrapatos em macacos rhesus. A primeira camada é composta de espuma Biatane. A aba é colocada na parte superior da espuma e a Duoderm é a terceira camada. clique aqui para ampliar figura .

Figura 5
Figura 5. Ixodes scapularis tick-alimentando-se de macacos rhesus. A) O dispositivo de contenção completa. B, C) ​​Vistas de carrapatos alimentam através do dispositivo, e após a remoção do retalho. D) O local de alimentação carrapato após a remoção completa do dispositivo.

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Discussion

A fim de obter as carraças que porto B. burgdorferi para estudos a jusante, os carrapatos podem ser: (1) alimentados em camundongos infectados na fase de larva, (2) imersa em B. culturas burgdorferi, quer no estágio larval ou ninfal 48; (3) microinjeção com B. burgdorferi 47, ou (4) do tubo capilar alimentados B. burgdorferi 49. Enquanto cada um destes métodos tem a sua finalidade, para garantir que uma grande parte dos carrapatos a ser utilizado para a infecção B. porto burgdorferi, favorecemos a alimentação por sonda capilar. Se a inoculação com quantidades conhecidas de espiroquetas não é necessário, os métodos de alimentação capilar pode ter um menor potencial para danificar os carrapatos. Isto é de importância se eles estão a ser alimentados em animais. Este método também pode ser preferível se os investigadores estão a testar os mutantes para transmissibilidade / infecciosidade. É importante reconhecer que o crescimento em cultura pode resultar em perda de plasmídeo de 52, de modo que o uso debaixa passagem B. burgdorferi é essencial. Além disso, o meio e densidade das espiroquetas é artificial após a introdução, de modo que os carrapatos não deve ser utilizado imediatamente após a alimentação capilar. Em vez disso, um período de não menos do que duas semanas é permitida para as espiroquetas para se adaptar ao microambiente tique antes da sua utilização nas experiências.

Ao alimentar carrapatos em ratos, não é necessário fazer a barba os ratos de antemão. Em um estudo anterior (não publicado), na qual buscou-se examinar os efeitos da saliva do carrapato na pele, depilação era necessário. Ao fazê-lo, e contra intuitivamente, descobrimos que os carrapatos: a) anexar facilmente a pele sem pêlos, b) têm uma taxa de alimentação de alta, e c) são facilmente visíveis. As taxas de alimentação variam dependendo se as larvas ou ninfas são usadas, mas são sempre superiores a 50% quando são usados ​​ninfas. Como tal, raspando camundongos antes da alimentação tornou-se prática comum em nosso laboratório, não só para os experimentos, mas também para a propagação da colônia. Anteriormente, em nossa divisão no National Primate Research Center Tulane, 34 macacos foram alimentados em cima por 770 ninfas Ixodes em cinco estudos diferentes. Assinale taxas de alimentação (# fed / # adicionado ao cápsulas) média de 35,2%, variando entre 23,5-52,5%. Em estudos de infecção, as taxas de transmissão média de 86,5%. Em um estudo piloto recente (não publicado), carrapato alimentando as taxas variaram 5-75% e nenhuma resistência à alimentação subseqüente era aparente. No entanto, as taxas de sucesso entre as tentativas de 2 e 3 variou significativamente, onde as taxas de alimentação foram muito mais elevados para a tentativa 3 º que para o 2 º. Os carrapatos "tentativa 2" foram alojados em temperatura ambiente maior do que a "tentativa 3" carrapatos. O fator mais importante, descobrimos que afeta a alimentação carrapato é a idade carrapato e ambiente pré-experimento. Aqueles mantido a 4 ° C pós-muda pouco antes usar geralmente se alimentam melhor. Como tal, recomenda-se continuamente propagação carrapatos, armazenando-os accordingly e ter dois lotes separados de carrapatos disponíveis ao realizar a alimentação de animais.

Em nosso estudo mais recente (não publicado) comparamos alimentação carrapatos em macacos usando a cápsula para alimentação com o dispositivo de aba. Dez macacos foram alimentados uma vez em cima com cápsulas e duas vezes com LeFlap. Neste conjunto de experimentos, observamos e taxa de alimentação média de 17% (intervalo de 5-25%) com cápsulas e uma taxa média de 54,75% (entre 35-90%) com a aba. Nós presumimos que a área de superfície mais ampla para a alimentação carrapato ea redução do uso de adesivos duras melhora alimentação. Utilização de contenção aba também permite que os investigadores que quer deixar carrapatos alimentar mais ou adicionar mais carrapatos, como a carraça pode ser removido sem a remoção de todo o dispositivo. Por fim, apesar de os adesivos podem causar irritação da pele suave em alguns animais (o que poderia afectar ou induzir respostas imunitárias cutâneas) o próprio dispositivo de aba pode ter limitada, se alguma, desconforto para os animais.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer a Nicole Hasenkampf e Amanda Tardo para suporte técnico. Agradecemos também drs. Linden Hu e Adriana Marques por recomendação do dispositivo de contenção LeFlap e Dr. Lise Gern para obter instruções sobre o método de alimentação capilar. Este trabalho foi financiado pelo NIH / NCRR Grant 8 P20 GM103458-09 (MEE) e pelo Centro Nacional de Pesquisa de Recursos e do Escritório de Pesquisa Programas de Infra-estrutura (OriP) dos Institutos Nacionais de Saúde, através de concessão P51OD011104/P51RR000164.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
BSK-H Sigma B-8291
Ketamine HCl
Tangle Trap coating Paste Ladd research T-131
SkinPrep Allegro Medical Supplies 177364
LeFlap, 3" x 3" Monarch Labs
Hypafix tape Allegro Medical Supplies 191523
SkinBond Allegro Medical Supplies 554536
UniSolve Allegro Medical Supplies 176640
Biatane Foam, adhesive 4"x4" Coloplast 3420
DuoDerm CGF Dressing - 4" x 4", (3/4)" adhesive border Convatec 187971
Nonhuman primate jackets with flexible 2" back panels; add drawstrings at top and bottom Lomir Biomedical Inc.
EQUIPMENT
Pipet puller David Kopf Instruments Model 700C
Dark field microscope Leitz Wetzlar Dialux
Dissecting microscope Leica Zoom 2000
Mouse caging Allentown caging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Porcella, S. F., Schwan, T. G. Borrelia burgdorferi and Treponema pallidum: a comparison of functional genomics, environmental adaptations, and pathogenic mechanisms. Journal of Clinical Investigation. 107, 651-656 (2001).
  2. Fraser, C. M., et al. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. Nature. 390, 580-586 (1997).
  3. Casjens, S., et al. A bacterial genome in flux: the twelve linear and nine circular extrachromosomal DNAs in an infectious isolate of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Molecular Microbiology. 35, 490-516 (2000).
  4. Carroll, J. A., Garon, C. F., Schwan, T. G. Effects of environmental pH on membrane proteins in Borrelia burgdorferi. Infection & Immunity. 67, 3181-3187 (1999).
  5. Gilmore, R. D., Mbow, M. L., Stevenson, B. Analysis of Borrelia burgdorferi gene expression during life cycle phases of the tick vector Ixodes scapularis. Microbes & Infection. 3, 799-808 (2001).
  6. Ramamoorthy, R., Philipp, M. T. Differential expression of Borrelia burgdorferi proteins during growth in vitro. Infection & Immunity. 66, 5119-5124 (1998).
  7. Ramamoorthy, R., Scholl-Meeker, D. Borrelia burgdorferi proteins whose expression is similarly affected by culture temperature and pH. Infection & Immunity. 69, 2739-2742 (2001).
  8. Schwan, T. G., Piesman, J. Temporal Changes in Outer Surface Proteins A and C of the Lyme Disease-Associated Spirochete, Borrelia burgdorferi, during the Chain of Infection in Ticks and Mice. J. Clin. Microbiol. 38, 382-388 (2000).
  9. Barthold, S. W., de Souza, M. S., Janotka, J. L., Smith, A. L., Persing, D. H. Chronic Lyme borreliosis in the laboratory mouse. Am. J. Pathol. 143, 959-971 (1993).
  10. Barthold, S. W., de Souza, M. Exacerbation of Lyme arthritis in beige mice. Journal of Infectious Diseases. 172, 778-784 (1995).
  11. Barthold, S. W., Feng, S., Bockenstedt, L. K., Fikrig, E., Feen, K. Protective and arthritis-resolving activity in sera of mice infected with Borrelia burgdorferi. Clin. Infect. Dis. 25, Suppl 1. S9-S17 (1997).
  12. Miller, J. C., Ma, Y., Crandall, H., Wang, X., Weis, J. J. Gene expression profiling provides insights into the pathways involved in inflammatory arthritis development: Murine model of Lyme disease. Experimental and Molecular Pathology. 85, 20-27 (2008).
  13. Purser, J. E., Norris, S. J. Correlation between plasmid content and infectivity in Borrelia burgdorferi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13865-13870 (2000).
  14. Grimm, D., et al. Outer-surface protein C of the Lyme disease spirochete: a protein induced in ticks for infection of mammals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 3142-3147 (2004).
  15. Zhang, J. R., Norris, S. J. Kinetics and in vivo induction of genetic variation of vlsE in Borrelia burgdorferi. Infection & Immunity. 66 (1), 3689-3697 (1999).
  16. Hodzic, E., Feng, S., Freet, K. J., Borjesson, D. L., Barthold, S. W. Borrelia burgdorferi population kinetics and selected gene expression at the host-vector interface. Infection & Immunity. 70, 3382-3388 (2002).
  17. Hodzic, E., Feng, S., Freet, K. J., Barthold, S. W. Borrelia burgdorferi population dynamics and prototype gene expression during infection of immunocompetent and immunodeficient mice. Infection & Immunity. 71, 5042-5055 (2003).
  18. Liang, F. T., Nelson, F. K., Fikrig, E. Molecular adaptation of Borrelia burgdorferi in the murine host. Journal of Experimental Medicine. 196, 275-280 (2002).
  19. Samuels, D. S. Gene Regulation in Borrelia burgdorferi. Annual Review of Microbiology. 65, 479-499 (1146).
  20. Gilmore, R. D., et al. The bba64 gene of Borrelia burgdorferi, the Lyme disease agent, is critical for mammalian infection via tick bite transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 7515-7520 (2010).
  21. Fisher, M. A., et al. Borrelia burgdorferi σ54 is required for mammalian infection and vector transmission but not for tick colonization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 5162-5167 (2005).
  22. Barthold, S. W. Animal models for Lyme disease. Laboratory Investigation. 72, 127-130 (1995).
  23. Pachner, A. R. Early disseminated Lyme disease: Lyme meningitis. American Journal of Medicine. 98, 30S-37S (1995).
  24. Barthold, S. W., Beck, D. S., Hansen, G. M., Terwilliger, G. A., Moody, K. D. Lyme Borreliosis in Selected Strains and Ages of Laboratory Mice. Journal of Infectious Diseases. 162, 133-138 (1990).
  25. Philipp, M. T., Johnson, B. J. Animal models of Lyme disease: pathogenesis and immunoprophylaxis. Trends in Microbiology. 2, 431-437 (1994).
  26. Roberts, E. D., et al. Pathogenesis of Lyme neuroborreliosis in the rhesus monkey: the early disseminated and chronic phases of disease in the peripheral nervous system. Journal of Infectious Diseases. 178, 722-732 (1998).
  27. Roberts, E. D., et al. Chronic lyme disease in the rhesus monkey. Laboratory Investigation. 72, 146-160 (1995).
  28. Philipp, M. T., et al. Early and early disseminated phases of Lyme disease in the rhesus monkey: a model for infection in humans. Infection & Immunity. 61, 3047-3059 (1993).
  29. Steere, A. C., Sikand, V. K. The Presenting Manifestations of Lyme Disease and the Outcomes of Treatment. N. Engl. J. Med. 348, T. reatment.N. .E. ngl.J. .M. ed. 348, 2472-2474 (2003).
  30. Pachner, A. R., Delaney, E., O'Neill, T., Major, E. Inoculation of nonhuman primates with the N40 strain of Borrelia burgdorferi leads to a model of Lyme neuroborreliosis faithful to the human disease. Neurology. 45, 165-172 (1995).
  31. Cadavid, D., O'Neill, T., Schaefer, H., Pachner, A. R. Localization of Borrelia burgdorferi in the nervous system and other organs in a nonhuman primate model of lyme disease. Laboratory Investigation. 80, 1043-1054 (2000).
  32. Mather, T. N., Wilson, M. L., Moore, S. I., Ribiero, J. M. C., Spielman, A. Comparing the Relative Potential of Rodents as Reservoirs of the Lyme Disease Spirochete (Borrelia Burgdorferi). American Journal of Epidemiology. 130, 143-150 (1989).
  33. Mather, T. N., Telford, S. R. Iii, Moore, S. I., Spielman, A. Borrelia burgdorferi and Babesia microti: Efficiency of transmission from reservoirs to vector ticks (Ixodes dammini). Experimental Parasitology. 70 (90), 55-61 (1990).
  34. Telford, S. R., Mather, T. N. 3rd, Adler, G. H., Spielman, A. Short-tailed shrews as reservoirs of the agents of Lyme disease and human babesiosis. Journal of Parasitology. 76, 681-683 (1990).
  35. Mather, T. N., Fish, D., Coughlin, R. T. Competence of dogs as reservoirs for Lyme disease spirochetes (Borrelia burgdorferi). J. Am. Vet. Med. Assoc. 205, 186-188 (1994).
  36. Telford, S. R., Mather, T. N. 3rd, Moore, S. I., Wilson, M. L., Spielman, A. Incompetence of deer as reservoirs of the Lyme disease spirochete. Am. J. Trop. Med. Hyg. 39, 105-109 (1988).
  37. Lin, T., et al. Analysis of an Ordered, Comprehensive STM Mutant Library in Infectious Borrelia burgdorferi: Insights into the Genes Required for Mouse Infectivity. PLoS ONE. 7, e47532 (2012).
  38. Lin, T., et al. Central Role of the Holliday Junction Helicase RuvAB in vlsE Recombination and Infectivity of Borrelia burgdorferi. PLoS Pathog. 5, e1000679 (2009).
  39. Jacobs, M. B., Norris, S. J., Phillippi-Falkenstein, K. M., Philipp, M. T. Infectivity of the Highly Transformable BBE02- lp56- Mutant of Borrelia burgdorferi, the Lyme Disease Spirochete, via Ticks. Infection and Immunity. 74, 3678-3681 (2006).
  40. Jacobs, M. B., Purcell, J. E., Philipp, M. T. Ixodes scapularis ticks (Acari: Ixodidae) from Louisiana are competent to transmit Borrelia burgdorferi, the agent of Lyme borreliosis. J. Med. Entomol. 40, 964-967 (2003).
  41. Bockenstedt, L., Mao, J., Hodzic, E., Barthold, S., Fish, D. Detection of Attenuated, Noninfectious Spirochetes in Borrelia burgdorferi-Infected Mice after Antibiotic Treatment. The Journal of Infectious Diseases. 186, 1430-1437 (2002).
  42. Barthold, S. W., et al. Ineffectiveness of tigecycline against persistent Borrelia burgdorferi. Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 54, 643-651 (2010).
  43. de Silva, A. M., Telford, S. R., Brunet, L. R. 3rd, Barthold, S. W., Fikrig, E. Borrelia burgdorferi OspA is an arthropod-specific transmission-blocking Lyme disease vaccine. Journal of Experimental Medicine. 183, 271-275 (1996).
  44. Fikrig, E., et al. Vaccination against Lyme disease caused by diverse Borrelia burgdorferi. Journal of Experimental Medicine. 181, 215-221 (1995).
  45. Philipp, M. T., et al. The outer surface protein A (OspA) vaccine against Lyme disease: efficacy in the rhesus monkey. Vaccine. 15, 1872-1887 (1997).
  46. Embers, M. E., et al. Persistence of Borrelia burgdorferi in Rhesus Macaques following Antibiotic Treatment of Disseminated Infection. PLoS ONE. 7, e29914 (2012).
  47. Kariu, T., Coleman, A. S., Anderson, J. F., Pal, U. Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut. J. Vis. Exp. , e2544 (2011).
  48. Policastro, P. F., Schwan, T. G. Experimental infection of Ixodes scapularis larvae (Acari: Ixodidae) by immersion in low passage cultures of Borrelia burgdorferi. J. Med. Entomol. 40, 364-370 (2003).
  49. Broadwater, A. H., Sonenshine, D. E., Hynes, W. L., Ceraul, S., de Silva, A. M. Glass Capillary Tube Feeding: A Method for Infecting Nymphal Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) with The Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi. Journal of Medical Entomology. 39, 285-292 (2002).
  50. Hodzic, E., Feng, S., Holden, K., Freet, K. J., Barthold, S. W. Persistence of Borrelia burgdorferi following antibiotic treatment in mice. Antimicrob Agents Chemother. 52, 1728-1736 (2008).
  51. Bockenstedt, L. K., Mao, J., Hodzic, E., Barthold, S. W., Fish, D. Detection of attenuated, noninfectious spirochetes in Borrelia burgdorferi-infected mice after antibiotic treatment. Journal of Infectious Diseases. 186, 1430-1437 (2002).
  52. Schwan, T. G., Burgdorfer, W., Garon, C. F. Changes in infectivity and plasmid profile of the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi, as a result of in vitro cultivation. Infection and Immunity. 56, 1831-1836 (1988).

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Embers, M. E., Grasperge, B. J., Jacobs, M. B., Philipp, M. T. Feeding of Ticks on Animals for Transmission and Xenodiagnosis in Lyme Disease Research. J. Vis. Exp. (78), e50617, doi:10.3791/50617 (2013).

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