Biosensors Ratiométrique qui mesurent l'état redox mitochondrial et de l'ATP dans les cellules vivantes de levure

Summary

Nous décrivons l'utilisation de deux ratiométriques, biocapteurs génétiquement codés, qui sont fondés sur la GFP, pour surveiller l'état redox mitochondrial et les niveaux d'ATP à une résolution subcellulaire dans les cellules de levure vivantes.

Abstract

Les mitochondries jouent un rôle dans de nombreux processus cellulaires, du métabolisme énergétique et l'homéostasie du calcium au contrôle de la durée de vie cellulaire et la mort cellulaire programmée. Ces processus affectent et sont affectés par l'état redox et la production d'ATP par les mitochondries. Ici, nous décrivons l'utilisation de deux ratiométriques, biocapteurs génétiquement codés qui peuvent détecter l'état redox mitochondrial et les niveaux d'ATP à une résolution subcellulaire dans les cellules de levure vivante. État redox mitochondrial est mesurée à l'aide Green Fluorescent Protein redox-sensibles (roGFP) qui est destiné à la matrice mitochondriale. Mito-roGFP contient résidus cystéine en positions 147 et 204 de la GFP, qui subissent une oxydation et une réduction réversible et dépendant de l'environnement, qui à son tour modifie le spectre d'excitation de la protéine. MitGO-ATeam est un transfert d'énergie par résonance de Förster (FRET) de la sonde, dans lequel la sous-unité de l'ε _o F F _1-ATP synthase est prise en sandwich entre donneur et l'accepteur FRET fluoprotéines centes. La liaison de l'ATP de la ε résultats des sous-unités dans des changements de conformation de la protéine qui apportent le donneur et l'accepteur de FRET à proximité immédiate et de permettre un transfert d'énergie de fluorescence par résonance à partir du donneur à l'accepteur.

Introduction

Les mitochondries sont des organites essentiels pour la production d'ATP, la biosynthèse des acides aminés, des acides gras, l'hème, clusters fer-soufre et pyrimidines. Les mitochondries jouent également un rôle essentiel dans l'homéostasie du calcium, et dans la régulation de l'apoptose. ¹ en plus de preuves des liens mitochondries au vieillissement et aux maladies liées au vieillissement, y compris la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, la sclérose latérale amyotrophique et la maladie de Huntington. ² Bien que les individus vivent leur vie entière avec des mutations dans des protéines mitochondriales qui sont associés à des maladies neurodégénératives, les symptômes de la maladie se produisent seulement plus tard dans la vie. Cela indique que les changements se produisent dans les mitochondries avec l'âge qui permet maladie pathologie à émerger. En effet, fitness mitochondrial est corrélée à la santé globale de la cellule et la durée de vie de la levure et des cellules de mammifères ^3,4 Ici., Nous décrivons comment utiliser biocapteurs fluorescents génétiquement codés, ratiométriques d'évaluer deux caractéristiques essentielles de Mitochondria dans les cellules de levure vivantes: état redox et les niveaux d'ATP.

La fonction mitochondriale dans la mobilisation de l'énergie aérobie est bien établie. L'état d'oxydo-réduction des mitochondries est un produit de réduction et d'oxydation des espèces dans l'organite, comprenant du NAD ⁺ / NADH, FAD / FADH _2, NADP ⁺ / NADPH, le glutathion / glutathion disulfure (GSH / GSSG) et les espèces réactives de l'oxygène (ROS). Découplage mitochondries ou hypoxie affecte l'activité respiratoire mitochondriale et modifie le rapport de NAD ⁺ en NADH dans l'organite. ROS, qui sont produits à partir de transfert d'électrons inefficace entre les complexes de la chaîne de transport des électrons dans la membrane mitochondriale interne, ainsi que de la désamination des amines par la monoamine oxydase dans la membrane mitochondriale externe ^5, les lipides des dommages, des protéines et des acides nucléiques et avoir été lié au vieillissement et les maladies neurodégénératives liées à l'âge ^6,7,8. ROS jouent également un rôle dans la transduction du signal en mitochondria, par oxydation du GSH. Par exemple, le NADH déshydrogénase contribue non seulement à la production de ROS, mais aussi est régulée par des interactions avec la piscine glutathion ^9,10. déshydrogénase α-cétoglutarate et aconitase, les composantes du cycle de Krebs, présentent une activité réduite en environnements oxydants ^11,12.

En effet, la régulation redox dépendant de l'activité aconitase est conservée, des bactéries aux mammifères ^13,14. Ainsi, la surveillance de l'état redox et les niveaux d'ATP des mitochondries est cruciale pour comprendre leur fonction et leur rôle dans la pathologie de la maladie.

Méthodes biochimiques ont été utilisés pour évaluer l'état d'oxydoréduction ou les niveaux d'ATP des cellules entières ou des mitochondries isolées. Méthodes largement utilisée pour évaluer l'état redox des cellules entières ou des mitochondries isolées sont basés sur la mesure des niveaux de la paire redox GSH / GSSG ^15. Le système luciférine-luciférase est couramment utilisé pour mesurer mitochondrialLes niveaux d'ATP dans les deux cellules entières perméabilisées ou les mitochondries isolées. ^{16,17,18,19,20} Dans cet essai, la luciférase se lie à l'ATP et catalyse l'oxydation de chimiluminescence et de luciférine. ²¹ L'intensité de la lumière émise est proportionnelle à la quantité de l'ATP dans le milieu réactionnel. ²²

Ces méthodes ont révélé des informations fondamentales sur la fonction mitochondriale, y compris la constatation que les patients atteints de maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer, ont des niveaux anormalement bas d'ATP. ²³ Toutefois, ils ne peuvent être utilisés à l'image vivants, des cellules intactes. En outre, les méthodes basées sur l'analyse de cellules entières fournissent une moyenne de l'état d'oxydoréduction ou les niveaux d'ATP dans tous les compartiments de la cellule. Mesures en organites isolés sont potentiellement problématique car l'état redox mitochondrial ou les niveaux d'ATP peuvent changer au cours du fractionnement subcellulaire. Enfin, des études récentes de notre laboratoire et d'autres indiquent quemitochondries dans les cellules individuelles sont hétérogènes en fonction, ce qui influe sur la durée de vie des cellules de la mère et la fille. ³ Ainsi, il est nécessaire de mesurer les niveaux d'ATP mitochondriale et de l'état d'oxydo-réduction dans les cellules vivantes avec une résolution subcellulaire.

Les biocapteurs pour la fonction mitochondriale décrites ici sont toutes deux basées sur la GFP. GFP redox sensible (roGFP) ^24,25 est un variant de la GFP dans lequel cystéines exposées à la surface sont ajoutés à la molécule. roGFP, comme GFP de type sauvage, présente deux pics d'excitation (à ~ 400 nm et ~ 480 nm) et une pointe d'émission à ~ 510 nm. L'oxydation des résidus cystéine dans les résultats roGFP par une augmentation de l'excitation à ~ 400 nm. La réduction de ces cystéines favorise excitation à ~ 480 nm. Ainsi, le rapport entre l'émission de 510 nm lors d'une excitation de roGFP à 480 nm et 400 nm révèle la quantité relative de roGFP réduite et oxydée, qui reflète l'état d'oxydo-réduction de l'environnement du fluorophore.

Deux versions de roGFP sont largement utilisés: roGFP1 et roGFP2. Les deux contiennent les mêmes insertions de cystéine. roGFP1 sont basées sur le GFP de type sauvage et roGFP2 est basée sur S65T GFP, qui a une excitation efficace à 480 nm et inférieure d'excitation efficace à 400 nm par rapport à wtGFP ^24. roGFP1 est moins sensible au pH que roGFP2 et sa gamme dynamique s'étend plus loin dans la plage réduite. Ainsi, roGFP1 peut être plus utile pour surveiller les compartiments plus réducteurs tels que les mitochondries ou le cytosol, et des compartiments dont le pH est variable, comme les endosomes. roGFP2 propose signaux lumineux et, dans certaines études, une gamme dynamique supérieure à roGFP1 ^24,26. Des études chez Arabidopsis thaliana indiquent que le temps nécessaire pour une réponse à des changements dans l'état d'oxydo-réduction est similaire pour les deux capteurs (t ½ pour l'oxydation, 65 et 95 secondes et t ½ de la réduction, 272 et 206 secondes, par roGFP1 et roGFP2, respectivement) ^26.

MitGO-ATeam2 est un mini-invasive, fiablecapteur qui mesure ATP mitochondrial chez la levure Saccharomyces cerevisiae. GO-ATeam est un transfert d'énergie par résonance de Förster (FRET) de la sonde qui se compose de la sous-unité ε du F _o F _1-ATP synthase en sandwich entre donneur de FRET et protéines fluorescentes accepteurs (GFP et orange fluorescent protein (OFP), respectivement). ²⁷ La liaison de l'ATP de la ε résultats des sous-unités dans des changements conformationnels de la protéine qui apportent le FRET donneur à proximité immédiate de l'accepteur et pour permettre un transfert d'énergie du donneur à l'accepteur. Il existe deux variantes de GO-ATeam, GO-GO-ATeam1 et ATeam2. GO-ATeam2 a une plus grande affinité pour MgATP que GO-ATeam1, le rendant plus adapté pour mesurer le typiquement inférieure [ATP] dans les mitochondries par rapport au cytosol. ²⁷

Afin de sonder l'état redox mitochondrial, nous avons construit une protéine de fusion (mito-roGFP1) composé de roGFP1 fusionnée à la séquence leader ATP9 unend exprimé à partir d'une expression de levure centromere basé (faible nombre de copies) plasmide sous le contrôle de la forte glycéraldéhyde-3-phosphate (GPD) promoteur (p416GPD, Addgene). Nous avons utilisé roGFP1 pour sonder l'état d'oxydo-réduction des mitochondries dans le contexte de vieillissement du modèle champignon Saccharomyces cerevisiae. Nous constatons que roGFP1 peut détecter des changements dans l'état redox mitochondrial qui se produisent au cours du vieillissement et en réponse à la disponibilité des nutriments mais n'a aucun effet néfaste apparent sur des cellules de levure. Nous voyons aussi une variabilité dans l'état redox des mitochondries dans les cellules de levure de vie individuels, une constatation qui souligne l'importance d'un biocapteur avec une résolution spatiale subcellulaire.

MitGO-ATeam2 est une variante du GO-ATeam2, qui a la séquence signal mitochondrial du cytochrome c oxydase sous-unité VIII inséré à l'extrémité amino-terminale de GO-ATeam2 ^27. Nous avons modifié la sonde mitGO-ATeam2 (aimablement fourni par le laboratoire de H. Noji, Institut of recherche scientifique et industrielle, Université d'Osaka, Japon) pour une utilisation dans la levure par sous-clonage, via les sites HindIII Xba1 et, dans le vecteur d'expression de levure pAG415GPD-ccdB (Addgene, Cambridge, MA, USA), qui est un faible nombre de copies de plasmide contenant le promoteur constitutif fort GPD. Nous avons exprimé mitGO-ATeam2 dans la levure bourgeonnante, et de trouver, par la contre avec la liaison à l'ADN colorant DAPI, qu'il localise exclusivement vers les mitochondries, où il sert comme une sonde efficace pour mesurer les changements physiologiques dans les niveaux d'ATP mitochondrial.

roGFP et GO-ATeam sont à la fois codées génétiquement. En conséquence, ils peuvent être introduits et maintenus de façon stable dans des cellules intactes, et fournissent des informations sur l'état d'oxydoréduction ou ATP dans les cellules vivantes, individuels. En outre, les deux biocapteurs surveiller les changements dans l'état d'oxydoréduction ou les niveaux d'ATP qui se produisent dans des conditions physiologiques. ²⁸ Les deux sondes sont également quotientométrique. En conséquence, les mesures faites avec ces sondes ne sont pas affectés par changes de concentration biocapteur ou un éclairage ou une épaisseur échantillon. Enfin, les deux biocapteurs offrent une résolution spatiale subcellulaire. En effet, roGFP a été ciblé à la mitochondrie, ER, les endosomes et les peroxysomes ^24, et peut détecter des changements dans l'état redox de chacun de ces organites, largement indépendantes du pH.

Protocol

1. Transformation des cellules de levure avec les biocapteurs Transformer la souche de levure désirée avec plasmide portant mito-roGFP ou mitGO-ATeam2 selon la méthode de l'acétate de lithium 27. Pour confirmer transformation avec le biocapteur plasmidique et pour éviter la perte du plasmide, sélectionner et maintenir transformants sur milieu complet synthétique sélectif approprié (SC-Ura pour mito-roGFP, ou SC-Leu pour mitGo-ATeam2). Si la sonde fluorescente a été sous-clo…

Representative Results

Mesurer l'état redox mitochondrial avec mito-roGFP Ici, nous montrons que mito-roGFP1 a la plage dynamique pour détecter des changements dans l'état redox mitochondrial totalement oxydé à réduit dans les cellules de levure vivante, sans affecter la croissance des cellules de levure ou de la morphologie mitochondriale. Tout d'abord, nous trouvons les cellules exprimant la GFP mitochondries ciblée et roGFP1 croître à des taux normaux (figure 1A). Le taux de c…

Discussion

Ici, nous décrivons les méthodes à utiliser mito-roGFP1 et mitGO-ATeam2 comme biocapteurs pour évaluer l'état redox mitochondrial et les niveaux d'ATP dans les cellules de levure vivante. Nous constatons que l'expression du plasmide d'origine mito-roGFP1 ou mitGO-ATeam résultats dans le ciblage quantitatif aux mitochondries, sans aucun effet évident sur ​​la morphologie ou la distribution mitochondrial ou sur les taux de croissance cellulaire. ³ Mito-roGFP1 peut détecter des change…

Materials

			Reagents
Antimycin A	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	1397-94-0	Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.
SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glycerol 0.05% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
Valap			Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 °C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin
			Equipment and Software
Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides	Thomas Scientific (Swedesboro, NJ)	3050	Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm
High-performance coverslips, No. 1.5, 18×18 mm	Zeiss (Thornwood, NY)	474030-9000-000	These are less variable in thickness (170±5 μm) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance
Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5	Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)	12-545E	Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 μm)
A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective	Nikon (Melville, NY)
AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software	Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)
Volocity 3D Image Analysis software	Perkin Elmer (Waltham, MA)		Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement
ImageJ software	National Institutes of Health (Bethesda, MD)		http://rsb.info.nih.gov/ij/