Biosensores radiométricos que miden el estado redox mitocondrial y ATP en las células vivas de levadura

Summary

Se describe el uso de dos, biosensores ratiometric codificados genéticamente, que se basan en la GFP, para vigilar los niveles de ATP estado redox mitocondrial y en la resolución subcelular en células de levadura vivas.

Abstract

Las mitocondrias tienen papeles en muchos procesos celulares, de metabolismo de la energía y la homeostasis del calcio para el control de la vida celular y la muerte celular programada. Estos procesos afectan y se ven afectados por el estado redox y de la producción de ATP por las mitocondrias. Aquí, se describe el uso de dos, biosensores codificados genéticamente radiométricos que pueden detectar los niveles de ATP estado redox mitocondrial y en la resolución subcelular en células de levadura viva. Estado redox mitocondrial se mide usando sensible a redox Proteína Fluorescente Verde (roGFP) que está dirigido a la matriz mitocondrial. Mito-roGFP contiene cisteínas en las posiciones 147 y 204 de la GFP, que se someten a la oxidación y reducción reversible y dependiente del entorno, que a su vez altera el espectro de excitación de la proteína. MitGO-ATeam es una transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) sonda en la que la subunidad ε del F _o F _1-ATP sintasa se ​​intercala entre donante y aceptor de FRET fluoproteínas rescent. La unión de ATP a los resultados de la subunidad ε en cambios de conformación en la proteína que traen el donante de FRET y aceptor en estrecha proximidad y permiten la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia del donante al aceptor.

Introduction

Las mitocondrias son organelas esenciales para la producción de ATP, la biosíntesis de aminoácidos, ácidos grasos, hemo, clusters hierro-azufre y pirimidinas. Las mitocondrias también juegan un papel fundamental en la homeostasis del calcio, y en la regulación de la apoptosis. ¹ El aumento de enlaces evidencia mitocondrias a envejecimiento y relacionada con la edad las enfermedades incluyendo la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, y enfermedad de Huntington. ² Si bien las personas viven toda su vida con las mutaciones en las proteínas mitocondriales que están asociados con enfermedades neurodegenerativas, los síntomas de la enfermedad se producen sólo más tarde en la vida. Esto indica que los cambios se producen en las mitocondrias con la edad que permiten patología de la enfermedad a emerger. En efecto, fitness mitocondrial se correlaciona con la salud en general y la longevidad celular en levaduras y células de mamífero. ^3.4 Aquí se describe cómo utilizar biosensores fluorescentes genéticamente codificados, radiométricos para evaluar dos aspectos críticos de Mitochondria en células de levadura que viven: los niveles de ATP y el estado redox.

La función mitocondrial en la movilización de energía aeróbica está bien establecida. Estado redox mitocondrial es un producto de la reducción y las especies oxidantes en el orgánulo, incluyendo NAD ⁺ / NADH, FAD / FADH _2, NADP ⁺ / NADPH, glutatión / disulfuro de glutatión (GSH / GSSG) y especies reactivas de oxígeno (ROS). Desacoplar las mitocondrias o hipoxia afecta a la actividad respiratoria mitocondrial y altera la relación de NAD ⁺ a NADH en el orgánulo. ROS, que están producidos a partir de la transferencia de electrones ineficiente entre los complejos de la cadena de transporte de electrones en la membrana mitocondrial interna, así como de la desaminación de aminas a través de la monoamina oxidasa en la membrana mitocondrial externa ^5, daños en lípidos, proteínas, y ácidos nucleicos y tienen ha relacionado con el envejecimiento y enfermedades neurodegenerativas asociadas a la edad ^6,7,8. ROS también juegan un papel en la transducción de señal en mitochondria, a través de la oxidación de GSH. Por ejemplo, el NADH deshidrogenasa no sólo contribuye a la producción de ROS pero también está regulado a través de interacciones con la piscina glutatión ^9,10. α-cetoglutarato deshidrogenasa y aconitasa, componentes del ciclo del TCA, muestran una actividad reducida en ambientes oxidantes ^11,12.

En efecto, la regulación redox-dependiente de la actividad de la aconitasa se ​​conserva desde las bacterias hasta los mamíferos ^13,14. Por lo tanto, el control de la los niveles de ATP de las mitocondrias y del estado redox es crucial para la comprensión de su función y el papel en la patología de la enfermedad.

Métodos bioquímicos se han utilizado para evaluar el estado redox o los niveles de ATP de las células enteras o mitocondrias aisladas. Ampliamente métodos utilizados para evaluar el estado redox de las células enteras o las mitocondrias aisladas se basan en la medición de los niveles del par redox GSH / GSSG ^15. El sistema luciferina-luciferasa se utiliza comúnmente para medir mitocondrialLos niveles de ATP en cualquiera de las células enteras permeabilizadas o las mitocondrias aisladas. ^{16,17,18,19,20} En este ensayo, la luciferasa se ​​une a ATP y cataliza la oxidación y de quimioluminiscencia de luciferina. ²¹ La intensidad de la luz emitida es proporcional a la cantidad de ATP en la mezcla de reacción. ²²

Estos métodos han revelado la información fundamental sobre la función mitocondrial, incluyendo el hallazgo de que los pacientes con enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer, tienen niveles anormalmente bajos de ATP. ²³ Sin embargo, no se puede utilizar la imagen de vida, las células intactas. Por otra parte, los métodos basados ​​en el análisis de células enteras proporcionan un promedio de estado redox o los niveles de ATP en todos los compartimentos de la célula. Medidas en orgánulos aislados son potencialmente problemático porque los niveles de ATP estado o redox mitocondrial pueden cambiar durante el fraccionamiento subcelular. Por último, estudios recientes de nuestro laboratorio y otros indican que losmitocondrias dentro de las células individuales son heterogéneos en función, que a su vez afecta a la vida útil de las células madre y la hija. ³ Por lo tanto, hay una necesidad de medir los niveles de ATP mitocondrial y el estado redox en las células vivas con la resolución subcelular.

Los biosensores para la función mitocondrial aquí descritos están basados ​​en las buenas prácticas agrarias. GFP sensible a redox (roGFP) ^24,25 es una variante de GFP en el que se añaden expuestos en la superficie cisteínas de la molécula. roGFP, como GFP de tipo salvaje, tiene dos picos de excitación (400 nm a ~ y ~ 480 nm) y un pico de emisión a ~ 510 nm. La oxidación de los residuos de cisteína en los resultados roGFP en un aumento de la excitación a ~ 400 nm. Reducción de las cisteínas favorece excitación a ~ 480 nm. Por lo tanto, la relación de 510 nm de emisión tras la excitación de roGFP a 480 nm y 400 nm revela la cantidad relativa de reducido y oxidado roGFP, que refleja el estado redox del medio ambiente del fluoróforo.

Dos versiones de roGFP son ampliamente utilizados: roGFP1 y roGFP2. Ambos contienen las mismas inserciones de cisteína. roGFP1 se basa en GFP de tipo salvaje y roGFP2 se basa en S65T de GFP, que tiene de excitación más eficiente a 480 nm de excitación y menos eficiente a 400 nm en comparación con wtGFP ^24. roGFP1 es menos sensible al pH que roGFP2 y su rango dinámico se extiende aún más en la gama reducida. Por lo tanto, roGFP1 puede ser más útil para el seguimiento de los compartimentos más reductores tales como mitocondrias o el citosol, y compartimentos con pH variable, como los endosomas. roGFP2 ofrece la señal más brillante y, en algunos estudios, un mayor rango dinámico que roGFP1 ^24,26. Los estudios en Arabidopsis thaliana indican que el tiempo requerido para la respuesta a los cambios en el estado redox es similar para ambos sensores (t ½ para la oxidación, 65 y 95 segundos y t ½ para la reducción, 272 y 206 segundos, para roGFP1 y roGFP2, respectivamente). ²⁶

MitGO-ATeam2 es mínimamente invasivo y confiablesensor que mide de ATP mitocondrial en la levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae. GO-ATeam es una transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) sonda que consiste en la subunidad ε del F _o F _1-ATP sintasa intercalada entre FRET donante y aceptor proteínas fluorescentes (GFP y la proteína fluorescente de color naranja (OFP), respectivamente). ²⁷ La unión de ATP a los resultados de la subunidad ε en los cambios conformacionales en la proteína que traen el donante de FRET en estrecha proximidad con el aceptor y permiten la transferencia de energía del donante al aceptor. Hay dos variantes de GO-ATeam, GO-GO-ATeam1 y ATeam2. GO-ATeam2 tiene una mayor afinidad por MgATP de GO-ATeam1, por lo que es más adecuado para la medición de la típicamente inferior [ATP] en comparación con las mitocondrias al citosol. ²⁷

Para sondear estado redox mitocondrial, se construyó una proteína de fusión (mito-roGFP1) que consiste en roGFP1 fusionado a la secuencia líder de una ATP9ND expresa a partir de un centrómero basado en (bajo número de copias) plásmido de expresión de levadura bajo el control del fuerte deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato (GPD) promotor (p416GPD, Addgene). Se utilizó roGFP1 para sondear el estado redox de las mitocondrias en el contexto del envejecimiento del modelo hongo Saccharomyces cerevisiae. Encontramos que roGFP1 puede detectar cambios en el estado redox mitocondrial que se producen durante el envejecimiento y en respuesta a la disponibilidad de nutrientes, pero no tiene ningún efecto perjudicial evidente en células de levadura. También vemos que la variabilidad en el estado redox de las mitocondrias dentro de las células de levadura vivas individuales, un hallazgo que pone de relieve la importancia de un biosensor con subcelular resolución espacial.

MitGO-ATeam2 es una variante de GO-ATeam2, que tiene la secuencia señal mitocondrial del citocromo c oxidasa subunidad VIII bis se inserta en el extremo amino de GO-ATeam2. ²⁷ Hemos modificado la sonda mitGO-ATeam2 (amablemente proporcionados por el laboratorio de H. Noji, Instituto of Investigación Científica e Industrial de la Universidad de Osaka, Japón) para su uso en la levadura subclonando que, a través de Xba1 y sitios HindIII, en el vector de expresión de levadura pAG415GPD-ccdB (Addgene, Cambridge, MA, EE.UU.), que es una copia de baja plásmido que contiene el promotor fuerte de GPD constitutivo. Expresamos mitGO-ATeam2 en ciernes levadura, y encontramos, por tinción de contraste con el ADN vinculante tinte DAPI, que se localiza exclusivamente en la mitocondria, donde sirve como una sonda eficaz para medir los cambios fisiológicos en los niveles de ATP mitocondrial.

roGFP y GO-ATeam son tanto codificados genéticamente. Como resultado de ello, pueden ser introducidos y mantenidos de forma estable en células intactas, y proporcionan información sobre el estado redox o los niveles de ATP en las células individuales, que viven. Por otra parte, ambos biosensores seguimiento de los cambios en el estado redox o los niveles de ATP que se producen en condiciones fisiológicas. ²⁸ Ambas sondas también son radiométrica. Como resultado de ello, las mediciones realizadas con estas sondas no se ven afectados por changes en la concentración de biosensor o iluminación de la muestra o el espesor. Por último, ambos biosensores proporcionan subcelular resolución espacial. En efecto, roGFP se ha dirigido a las mitocondrias, ER, endosomas y peroxisomas ^24, y puede detectar cambios en el estado redox de cada uno de estos orgánulos, en gran medida independientes del pH.

Protocol

1. La transformación de células de levadura con los biosensores Transformación de la cepa de levadura deseada con cojinete plásmido mito-roGFP o mitGO-ATeam2 utilizando el método de acetato de litio 27. Para confirmar la transformación con el plásmido biosensor transmitidas y para prevenir la pérdida del plásmido, seleccionar y mantener los transformantes sobre el medio completo sintético selectivo apropiado (SC-ura para Mito-roGFP, o SC-Leu para mitGo-ATeam2). Si la sonda fluor…

Representative Results

Medición del estado redox mitocondrial con mito-roGFP Aquí, mostramos que mito-roGFP1 tiene el rango dinámico para detectar cambios en el estado redox mitocondrial de totalmente oxidado a reducido en células de levadura viva, sin afectar el crecimiento de células de levadura o en la morfología mitocondrial. En primer lugar, nos encontramos con las células que expresan GFP mitocondrias-dirigida y roGFP1 crecen a tasas normales (Figura 1A). La máxima tasa de crecimiento, …

Discussion

A continuación, se describen los métodos para utilizar mito-roGFP1 y mitGO-ATeam2 como biosensores para evaluar los niveles de ATP estado redox mitocondrial y en células de levadura viva. Encontramos que la expresión del plásmido transmitidas por Mito-roGFP1 o mitGO-ATeam resultados en orientación cuantitativa a las mitocondrias, sin ningún efecto evidente sobre la morfología o distribución mitocondrial o en las tasas de crecimiento celulares. ³ Mito-roGFP1 puede detectar cambios en el estado redox m…

Materials

			Reagents
Antimycin A	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	1397-94-0	Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.
SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glycerol 0.05% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
Valap			Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 °C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin
			Equipment and Software
Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides	Thomas Scientific (Swedesboro, NJ)	3050	Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm
High-performance coverslips, No. 1.5, 18×18 mm	Zeiss (Thornwood, NY)	474030-9000-000	These are less variable in thickness (170±5 μm) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance
Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5	Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)	12-545E	Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 μm)
A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective	Nikon (Melville, NY)
AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software	Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)
Volocity 3D Image Analysis software	Perkin Elmer (Waltham, MA)		Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement
ImageJ software	National Institutes of Health (Bethesda, MD)		http://rsb.info.nih.gov/ij/