シングル酵母細胞中のMAPK誘導発現の時間的な定量
Summary
フローサイトメトリーおよび顕微鏡検査に基づいて、二つの相補的な方法は、酵母におけるMAPK経路の活性化によって誘導される遺伝子発現の動態を、単一細胞レベルで、定量化を可能にする提示されている。
Abstract
単一細胞レベルでの遺伝子発現の定量化は、集団レベルで実行される測定に不明瞭新規調節機構をが明らかになりました。二つの方法に基づいて、顕微鏡およびフローサイトメトリーは、このようなデータを取得することができる方法を示すために提示される。酵母における高浸透圧グリセロールMAPK経路の活性化の際に誘導される蛍光レポーターの発現は、例として使用される。各方法の具体的な利点が強調表示されます。フローサイトメトリーは、細胞（10,000）を多数測定し、蛍光タンパク質の成熟遅い速度の独立したタンパク質発現の動力学を直接測定を提供する。顕微鏡による生細胞のイメージングは、少数の細胞におけるレポーターの成熟した形での測定に限定された対照的である。しかし、この技術によって生成されたデータ·セットは、複数のレポーターの組合せ及び空間的及び時間的情報のおかげで非常に豊富であることができる個々の細胞から得られた。これら二つの測定法の組み合わせはシグナル伝達経路によってタンパク質発現の調節に関する新たな洞察を提供することができます。
Introduction
伝達カスケードを介したシグナル伝達は、多くの場合、タンパク質の発現で絶頂に達する。この発現プロファイルの特徴付けは、生物学的経路の機能を理解する上で重要な要素です。アップレギュレートされたタンパク質およびその活性化の動態のスペクトルの同定は、例えば、マイクロアレイ、ノーザンブロットまたはウェスタンブロット1-3のような様々な技術によって達成することができる。しかしながら、これらの技術は、細胞の集団全体の応答を平均化する。タンパク質の発現の微調節を理解するためには、単一細胞レベルでの測定値を収集することが望ましい。理想的には、これらの測定は、根本的な経路の数学モデルを開発するために適し定量的データを提供すべきである。
顕微鏡およびフローサイトメトリー、理想的な定量的な単一細胞の測定値を提供するのに適している二つの技術、である。蛍光タンパク質とタンパク質の内因性のタグ付けはできるBeは、それらの発現レベル4を定量するために使用。タンパク質の末端における大きな蛍光部分の付加は、それを非機能的にすることができるので、それは、蛍光構築物の発現を駆動するプロモーターに基づいて、特定の発現レポーターを生成するために、多くの場合望ましい。このレポータータンパク質は、セルラーシステムに対して外因性であるため、セルに行われているシグナル伝達事象に影響を与えることはない。
顕微鏡法およびフローサイトメトリーの両方が広く酵母シグナリング分野で使用されてきた。例として、コールマン·ラーナーらは相関単一細胞では、酵母接合シグナル伝達カスケード5のノイズを定量化するために顕微鏡によって具体的かつ構成的に発現記者を交配の発現、Acarのと制御ネットワークを研究するフローサイトメトリーを使用し、同僚GAL遺伝子6の発現を制御する。以前の研究7において、我々はcombinatiを使用している出芽酵母では高浸透圧グリセロール（HOG）経路からの発現の出力を研究するため、これら2つの技術の上。このマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）経路は、超浸透圧ストレスによって誘発される。それは、およそ300の遺伝子の発現を生じる転写プログラムを誘導するために、細胞の核に移行しHOG1 MAPKの活性化をもたらす。このプロセスを研究するために、我々は、四重ビーナス蛍光タンパク質（STL1のp-QV）の発現を駆動STL1プロモーター（HOG1活性8に応答して特異的に誘導される遺伝子）に基づく発現レポーターを設計した。測定はフローサイトメトリー、蛍光レポーターを表現する人口のほんの一部に中間ストレスレベル（0.1MのNaCl）で細胞の2集団が存在することを発見した。今後も、この動作を調査するために顕微鏡を使用し、タンパク質発現におけるこのノイズは本質的な要因9に支配されたことを発見した。我カップLDさらにHOG1活動の同様のレベルを有する細胞が著しく異なる発現の結果を表示できることを確認します。これら2つの技術の組み合わせは、私たちはストレス応答遺伝子の遅いリモデリングは、単一細胞レベル7での発現の結果に影響を与えたかを証明することができました。
本論文では、顕微鏡によるタンパク質発現の定量化の一例として、超浸透圧ショックにより誘導されたP STL1-QVレポーターの式を使用し、フローサイトメトリー。 0.2 MのNaClストレスを受ける同じ株を、両方の技術を用いて研究した。これは、私たちは、これらの2つの高度に補完的な技術のいくつかの重要な違いを強調することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
顕微鏡検査
ConAを持つウェルの治療は、細胞の適切な画像化を確保するための重要なステップです。のConAをPBS（5 mg / ml）を、低溶解性を有するため、濾過工程は、フィルタリングされていない溶液中に存在し、撮像を妨害する大きな凝集物を除去することができる。細胞が処理された表面に比較的強く付着し、誘導溶液の添加は、刺激の前と後の継続的な追跡を可能にし、…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、これらの方法が開発されており、チューリッヒ連邦工科大学の生化学研究所のマティアスピーターと彼のグループに感謝します。この作品は、スイス国立科学財団によってサポートされています。
Materials
| Reagent | |||
| Yeast Nitrogen Base | ForMedium | CYN6202 | |
| CSM amino-acid mix | ForMedium | DCS0011 | |
| Concanavalin A | GE Healthcare | 17-0450-01 | |
| Cycloheximide | Fluka Aldrich Sigma | C7698 | Toxic |
| ySP9 | W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus | ||
| pSP34 | pRS305 pSTL1 (-800 -0) – quadruple V enus | ||
| Material | |||
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | |
| Microscope control software | Micro-manager | Ver 1.4.11 | |
| Incubation chamber | LIS | The Box | |
| Fluorescence light source | Lumencor | SpectraX | |
| Camera | Hamamatsu | Flash 4.0 | |
| Flow cytometer | BD | FACS calibur | |
| Sonicator bath | Telesonic | TUC-150 | |
| 8-well-slide | Thermo Lab-tek | 155409 | |
| 96-well-plate | Matrical bioscience | MGB096-1-2-LG | |
| FACS tube | BD Falcon | 352054 |
References
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