Временная Количественная оценка МАРК индуцированной экспрессии в единичных дрожжевых клеток
Summary
Два дополнительных методы, основанные на цитометрии потока и микроскопии представлены которые позволяют количественно, в уровне одной клетки, динамики экспрессии генов, вызванных активацией MAPK пути в дрожжах.
Abstract
Количественная оценка экспрессии генов на уровне одной клетки раскрывает новые регуляторные механизмы уведут в измерениях, выполненных на уровне населения. Два методы, основанные на микроскопии и проточной цитометрии представлены продемонстрировать, как такие данные могут быть приобретены. Выражение флуоресцентного репортера, индуцированной при активации высокой осмолярности глицерин пути МАРК в дрожжах используется в качестве примера. Особые преимущества каждого метода выделены. Проточная цитометрия измеряет большое количество клеток (10000) и обеспечивает прямое измерение динамики белка экспрессии независимо от медленных созревания кинетики флуоресцентного белка. Изображений живых клеток с помощью микроскопа является напротив ограничено измерением зрелой форме репортера в меньшем количестве клеток. Тем не менее, наборы данных, генерируемые этой техники может быть чрезвычайно богатые благодаря комбинации нескольких репортеров и в пространственном и временном информацииполучены из отдельных клеток. Сочетание этих двух методов измерений может доставить новый взгляд на регуляцию экспрессии белка на сигнальных путей.
Introduction
Сигнализация с помощью трансдукции каскадов часто достигает кульминации в экспрессии белков. Характеристика этого профиля экспрессии является ключевым элементом в понимании функции биологических путей. Идентификация спектра до регулируемых белков и динамики их активации может быть достигнуто различными способами, такими как микро-массивов, северных пятнами или западных помарки 1-3. Однако, эти методы в среднем отклик всей популяции клеток. Чтобы понять тонкую регуляцию экспрессии белков, желательно, чтобы собрать измерения на уровне одной клетки. В идеале, эти измерения должны также обеспечить количественные данные поддаются развивать математические модели базового пути.
Микроскопия и проточной цитометрии две методики, которые идеально подходят для доставки таких количественных измерений одной ячейки. Эндогенный мечение белков с флуоресцентным белком может бе используется для количественной оценки их уровня экспрессии 4. Однако, так как добавление большого флуоресцентного фрагмента в конце белка может сделать его нефункциональным, часто более желательны, чтобы генерировать определенные репортеров экспрессии на основе промотора движущей экспрессию флуоресцентного конструкции. Этот репортер белок экзогенными для сотовой системы и, следовательно, не влияет на сигнальные события, которые происходят в клетке.
Оба микроскопии и проточной цитометрии были широко использованы в поле сигнализации дрожжей. В качестве примеров; Колман-Лернер и его коллеги коррелирует, в одиночных камерах, выражение спаривания конкретные и конструктивно, высказанные журналистам с помощью микроскопии для количественной оценки шума в дрожжи спаривания передачи сигнала каскада 5, Акар и его коллеги использовали проточной цитометрии для изучения нормативно-сеть контролирующий экспрессию генов GAL 6. В предыдущем исследовании 7, мы использовали combinatiна этих двух методов для изучения выход экспрессии с высокой осмолярности глицерина (HOG) тропа в почкующихся дрожжей. Это митоген активированной протеинкиназы (МАРК) пути инициируется гипер-осмотического стресса. Это приводит к активации MAPK Hog1, который перемещает в ядро клетки, чтобы вызвать программу транскрипции, что приводит к экспрессии примерно 300 генов. Для изучения этого процесса, мы инженерии выражения репортера на основе STL1 промоутер (гена индуцируется в частности, в ответ на Hog1 деятельности 8) движущей выражение четырехместном Венеры флуоресцентного белка (р STL1-см.). Проточной цитометрии измерения обнаружили наличие двух популяций клеток на среднем уровне напряжения (0,1 М NaCl) и только часть населения, выражающей флуоресцентного репортера. Мы использовали микроскопию для дальнейшего расследования это поведение и обнаружил, что этот шум в экспрессии белка регулируется внутренними факторами 9. Мы CoUл.д. далее заметить, что клетки с аналогичным уровнем Hog1 деятельности может отображать поразительно разные результаты экспрессии. Сочетание этих двух методов позволило нам продемонстрировать, как медленно ремоделирования генов стресс-ответа повлияло на исход выражение в одном уровне клетки 7.
В данной работе мы используем выражение р STL1-QV репортера, вызванного гипер-осмотического шока в качестве примера количественной оценки экспрессии белка по микроскопии и проточной цитометрии. Этот же штамм подвергается 0,2 М NaCl стресса изучали с обоих методов. Это позволит нам выделить несколько ключевых различия в этих двух весьма дополнительных методов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Микроскопия
Лечение колодца с ConA является важным шагом для обеспечения надлежащего изображений клеток. Поскольку ConA имеет низкую растворимость в PBS (5 мг / мл), процесс фильтрования позволяет удаление больших агрегатов, которые присутствуют в нефильтрованной раствора и м?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Маттиас Петра и его группу в Институте биохимии в ETH в Цюрихе, где были разработаны эти методы. Эта работа была поддержана Национальным научным фондом Швейцарии.
Materials
| Reagent | |||
| Yeast Nitrogen Base | ForMedium | CYN6202 | |
| CSM amino-acid mix | ForMedium | DCS0011 | |
| Concanavalin A | GE Healthcare | 17-0450-01 | |
| Cycloheximide | Fluka Aldrich Sigma | C7698 | Toxic |
| ySP9 | W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus | ||
| pSP34 | pRS305 pSTL1 (-800 -0) – quadruple V enus | ||
| Material | |||
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | |
| Microscope control software | Micro-manager | Ver 1.4.11 | |
| Incubation chamber | LIS | The Box | |
| Fluorescence light source | Lumencor | SpectraX | |
| Camera | Hamamatsu | Flash 4.0 | |
| Flow cytometer | BD | FACS calibur | |
| Sonicator bath | Telesonic | TUC-150 | |
| 8-well-slide | Thermo Lab-tek | 155409 | |
| 96-well-plate | Matrical bioscience | MGB096-1-2-LG | |
| FACS tube | BD Falcon | 352054 |
References
- Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).
- de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F. The MAPK Hog1 recruits Rpd3 histone deacetylase to activate osmoresponsive genes. Nature. 427 (6972), 370-374 (2004).
- Ghaemmaghami, S., Huh, W. -. K., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
- Wu, J. -. Q., Pollard, T. D. Counting cytokinesis proteins globally and locally in fission yeast. Science. 310 (5746), 310-314 (2005).
- Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system. Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).
- Acar, M., Becskei, A., van Oudenaarden, A. Enhancement of cellular memory by reducing stochastic transitions. Nature. 435 (7039), 228-232 (2005).
- Pelet, S., Rudolf, F., Nadal-Ribelles, M., de Nadal, E., Posas, F., Peter, M. Transient activation of the HOG MAPK pathway regulates bimodal gene expression. Science. 332 (6030), 732-735 (2011).
- de Nadal, E., Casadome, L., Posas, F. Targeting the MEF2-like transcription factor Smp1 by the stress-activated Hog1 mitogen-activated protein kinase. Molecular and Cellular Biology. 23 (1), 229-237 (2003).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).
- Pelet, S., Dechant, R., Lee, S. S., van Drogen, F., Peter, M. An integrated image analysis platform to quantify signal transduction in single cells. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4 (10), 1274-1282 (2012).
- Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome biology. 7 (10), R100 (2006).
- Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry. Current protocols in molecular biology. Chapter 14, Unit 14.18 (2008).
- Dimopoulos, S., Mayer, C., Rudolf, F., Stelling, J. Automatic Single Cell Segmentation in a Variety of Microscopy Images. Current protocols in molecular biology. , (2012).
- Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering. Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 557-562 (2003).
- Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. Signal processing by the HOG MAP kinase pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (20), 7165-7170 (2008).
- Pepperkok, R., Ellenberg, J. High-throughput fluorescence microscopy for systems biology. Nature reviews Molecular cell biology. 7 (9), 690-696 (2006).
