Summary
Transgene og knockout musemodeller av nevrologiske sykdommer er nyttige for å studere rollen til gener i normale og unormale nevrofysiologi. Denne artikkelen beskriver metoder som kan brukes til å studere langsiktig potensering, en mobil mekanisme som kan ligge til grunn for læring og hukommelse, i transgene og knockout fritt oppfører musemodeller av nevropatologi.
Abstract
Studier av langtidspotensering av synaptisk effekt, en aktivitetsavhengig synaptisk fenomen som har egenskaper som gjør det attraktivt som en potensiell cellulær mekanisme underliggende læring og lagring av informasjon, har lenge blitt brukt til å belyse fysiologi av ulike nevrale kretser i hippocampus, amygdala , og andre limbiske og det kortikale strukturer. Med dette i bakhodet, transgene musemodeller av nevrologiske sykdommer representerer nyttige plattformer for å gjennomføre langsiktige (LTP) studier for å utvikle en større forståelse av rollen til gener i normale og unormale synaptisk kommunikasjon i nevrale nettverk som er involvert i læring, følelser og informasjon behandling. Denne artikkelen beskriver metoder for pålitelig indusere LTP i fritt oppfører musen. Disse metoder kan anvendes i studier av transgene og utstansing fritt oppfører musemodeller av neurodegenerative sykdommer.
Introduction
Utviklingen av teknologi for å manipulere gener har produsert transgene og knockout mus modeller av nesten hver nevrodegenerative og nevrologiske sykdommer. Dette har nødvendiggjort oversettelse av elektrofysiologiske forskning teknikker som tidligere er brukt i større gnagerarter til musen dyremodell. En slik nevrofysiologiske undersøkelser teknikk er bruken langvarig (LTP) for å teste effekten av synaptiske forbindelser i løpet av nevrale nettverk som er involvert i forskjellige neuropatologiske lidelser. Denne protokollen beskriver teknikker for pålitelig elektrofysiologisk undersøkelse av LTP i fritt oppfører mus. Fordelen med denne protokoll fremfor andre er at den er enkel og lett å gjennomføre, det er også noe mindre kostbart som det ikke krever hverken bruk av dyre datamaskinstyrt Microdrive systemer eller felteffekttransistor headstages, og, så vidt vi vet, er den første video-protokollen av kroniske elektrofysiologiske opptak to studere LTP i fritt oppfører mus. For å oppnå dette, vi beskriver i denne artikkelen enkle metoder for å studere langsiktig potensering i fritt oppfører mus. Disse metodene kan lett oversettes til transgene og knockout musemodeller av nevropatologiske lidelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen er hensiktsmessig for mus av tre og 18 måneders alder og omtrentlig kroppsvekt på 30-50 g). Mus kan fås fra The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Alle kirurgiske og eksperimentelle protokoller ble godkjent av Trinity College Animal Care og bruk komité og var i samsvar med NIH Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr.
En. Animal Forberedelse og kirurgiske prosedyrer
- Forbered anestesi cocktail inneholdende ketamin (25 mg / ml), xylazin (2,5 mg / ml) og acepromazin (0,5 mg / ml). Injiser 1 ml / kg kroppsvekt i den nedre høyre kvadrant av abdomen supplert med 0,2 ml / kg injeksjoner hver 45 min deretter å opprettholde en stabil dybde på anestesi ved hjelp av pedalen tilbaketrekking refleksen.
- Forbered bedøvet mus for kirurgi ved å barbere pelsen på sin kraniet ved hjelp av en elektrisk barbermaskin. Den barberte området bør inneholde midten av øynene til midten av ørene. Pass på å ikke barbere whiskers som de er en del av musen fat sensorisk system.
- Bruk bomullspinner å anvende isopropylalkohol etterfulgt av Betadin i det barberte område på hodet. Deretter, også ved hjelp av bomullspinner, påfør en liten mengde mineralolje på øynene for å forhindre øyeepler fra tørking.
- Bruk baby rotte øre mansjetter i stedet for vanlige øret barer å montere dyrets hode på stereotaxic ramme apparat. For å gjøre dette, må du først montere det venstre øret på venstre øre cuff. Deretter forsiktig lette høyre øre på høyre mansjetten ved forsiktig å støtte dyrets hode med en hånd og fremrykk øret mansjett med den andre hånden. Deretter plasserer en varmematte under dyrets kropp og sette den til 86 ° C for å opprettholde kroppstemperaturen.
- Sjekk deretter for bilateral stivhet ved å forsøke å bevege hodet fra side til side. Dyret er riktig montert på stereotaxic rammen når hodet er stive og kan ikke beveges sideveis, men lett kan dreies opp og ned.
- Forsiktig hvilemusens snute på nesen / tann bar forsamlingen å sørge for at fortennene hviler forsiktig, men sikkert i tannen blenderåpning på nesen / tann bar.
- Ved hjelp av en steril skalpell, gjør et midtlinje innsnitt som starter fra midten av øynene til midten av ørene. Kontroller at skalpell bli holdt i en 45 ° vinkel og gjelder nok press for å skjære gjennom den underliggende fascia, men ikke gjennom skallen som det vil føre til overdreven blødning.
- Bruk bomullspinner for å skille fascia og avsløre skallen. Landemerker Skull bregma og lambda skal være godt synlig (figur 1A). Sørg for at dyret er i skallen flat posisjon ved å justere nese / tann bar slik at Bregma og lambda landemerker er på samme den dorsoventral (DV) stilling (+ 0,1 mm).
- Påfør en liten mengde sterilt saltvann til de utsatte områdene og bruke bomullspinner til å forsiktig rense skallen. Deretter vente 2-3 min for skallen til helt lufttørkefør du fortsetter.
- Montere en nål på den venstre stereotaxic arm for å måle DV stilling bregma, og lambda. DV plassering av disse to nabo bør være innenfor 0,1 mm fra hverandre. Hvis ikke, kan nesen linjen i stereotaxic rammen justeres opp og ned for å oppnå dette.
- Plasser nålen på bregma å spille inn sin anterior-posterior (AP), lateral (LAT) og dorsoventral (DV) målinger. Pass på at nålen bare berører skallen og ikke trenge det.
- Bruke en mus hjerneatlas, som for eksempel "The Mouse Brain i Stereotaxic Koordinater" en, for å fastslå koordinatene for målet strukturer: medial perforant pathway (MPP) i vinkel bunt og dentate gyrus (DG) i hippocampus, i forhold til lambda og bregma, henholdsvis (se også tabell 1). Deretter bruker du en fin-point penn eller blyant til å markere disse punktene på skallen.
- Også markere to flere poeng på motsatt side av skallen. Disse punktene which vil tjene som jord (GND) og referanse (REF) bør være omtrent 3 mm fra midtlinjen og plassert i lengderetningen i forhold til hverandre (figur 1 A, også tabell 1).
- Fjern nålen markøren fra venstre stereotaxic arm og erstatte den med en elektrisk dental drill utstyrt med en stereotaktisk mount. Plasser boret over hver markert punkt og gjøre små grad hull på ca 0,5 mm i diameter. Når boring, bruke en repeterende opp-og-ned-bevegelse og sjekker ofte om drillen har trengt inn i skallen til å eksponere hjernens overflate.
- Forsiktig, men bestemt å kjøre en skrue elektrode (# 0-80 1/8 i rustfritt stål maskin skruer, Spår Rund hodet) i hver av de kontralaterale hull (GND og NR) slik at de så vidt berører kortikale overflate uten å trenge det (Figur 1A ). Disse to skrue elektroder tjener som jord-og referanse.
- Mount stimulerende og opptak elektroder i elektrode holdere på venstre og høyre stereotaksiske armer, henholdsvis.
- Forbind stimulerende elektrodeterminalene til en elektro stimulator med strøm isolasjon og opptakselektrodeterminalen til en elektrodifferensialforsterkeren (forsterkning = 1000, båndpassfilter = 1 Hz-3 kHz) og deretter til et digitalt oscilloskop for visuell inspeksjon av fremkalt respons. Også kobler GND og NR elektrodeterminalene til differensialforsterker.
- Forsiktig og sakte lavere både stimulerende og opptak elektroder i intervaller på 0,5 mm, mens visuelt overvåke evoked respons til en stimulus sjokk av 600-800 uA. Fortsett å senke hver elektrode til de når sine respektive mål DV stilling og en stereosignal blir observert på oscilloskop (figur 1B).
- Etterpå bruker tann akryl sement for å lage en lue for å holde elektrodeterminalene på plass, noe dental sement som berører huden tørkes avumiddelbart. Når dentalsement er fullstendig herdet overføre dyret fra stereotaxic rammen til et rent bur gnager. Bruk en varmelampe eller pad for å opprettholde kjernetemperatur.
- Overvåke dyr hver time før det kommer til bevissthet. En injeksjon av flunixin kan gis som et analgetikum.
2. LTP Induksjon
- La dyret 5-7 dager å komme seg etter operasjonen. Plasser dyret i innspillingen miljø bestående av et Faraday bur (122 cm x 43 cm x 43 cm) utstyrt med lyddempende materiale og en 5-kanals roterende kommutatoren koble elektroden fører til stimulerende / opptaksoppsettet.
- La dyret å akklimatisere seg for 1-2 timer i opptaksmiljøet før du kobler elektrodene til de stimulerende og registreringsinstrumenter (se trinn 1,17).
- Sett stimulatoren kontrollene til utgang 400 uA og registrere amplitude av et gjennomsnitt på 10 vakte reaksjoner gjør at thpå minst 10 sek utløp mellom stimuli. Bruk av fremgangsmåten vist i figur 1C, for å kvantifisere fremkalt respons. Gjenta denne prosedyren for 600, 800, 1000, 1200, og 1400 uA.
- Konstruer en inn / ut-kurve ved å plotte den gjennomsnittlige amplitude av den fremkalte respons versus stimulus intensitet. Fra dette plottet bestemme stimulus intensitet som svarer til 50% av den maksimale amplitude måles. Bruk 50% intensitet for resten av forsøket.
- Deretter, ved bruk av 50% stimulus intensitet, skaffe en grunnlinje ved å registrere den gjennomsnittlige amplitude av 5 fremkalt respons hvert minutt i 15 minutter. Igjen sørge for at minst 10 sek utløp mellom stimuli.
- Deretter levere tetanic stimulering som består av 10 pakker med 10 pulser levert på 400 Hz med en hastighet på 5 Hz til den mediale perforant veien. Overvåk dyret nøye for tegn på anfall, inkludert våte hunden rister. Hvis dyret har et beslag på experiment bør avsluttes, og alle data fra det dyret bør utelukkes fra studien resultatene.
- Deretter fortsetter å spille inn den gjennomsnittlige amplitude av 5 vakte reaksjoner hvert minutt i 30 min posttetanization. Etter det, sammenligne denne amplitude til referanse amplitude oppnådd i trinn 2.5, ved å beregne den prosentvise endring fra baselinje (figur 2).
- Etter avslutningen av eksperimenter, er dyret avlives ved hjelp av innånding av isofluran-en metode som er i samsvar med retningslinjene for Avliving av American Veterinary Medical Association.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tabell 1 viser koordinatene for DG og MPP som brukes i denne protokollen Figur 1a viser markeringene for målet strukturer på skallen;.. Også vist er plasseringen av tomter og referanseelektroder Figur 1B illustrerer representant fremkalt respons spor både pre- og posttetanization i det samme dyr. Legg merke til at posttetanization fremkalt respons er større enn pretetanization respons som er indikativ for LTP-induksjon 2. Figur 1C illustrerer fremgangsmåten anvendt for å kvantifisere responsen amplitude. Faktisk, Figur 2 viser prosent forandring i respons amplitude over et tidsforløp som strekker seg over både pre-og posttetanization tidsperioder. Det skal bemerkes at topp LTP-verdier overskredet 100%. Disse resultatene av forbedret respons amplitude følgende tetanization tyder på at denne protokollen er vellykket og derfor pålitelig for å studere LTPi fritt oppfører musemodell.
Tabell 1. Koordinater for målet strukturer. Anterior-posterior (AP) koordinater for dentate gyrus (DG) og NR er gitt i forhold til bregma mens de for medial perforant banen (MPP) og GND står i forhold til Lambda. Alle DV-koordinatene er relative til kortikale overflaten under dura.
Figur 1. Elektrode plassering og representative spor av fremkalt respons. A) viser skjematisk den relative plasseringen av elektrodene på mus skull. B) Typiske spor av den fremkalte respons både pre-og posttetanization. C) algoritme som brukes til å kvantifisere amplituden av fremmed reaksjon.
Figur 2. LTP i mediale perforant sti-dentate gyrus synapse. Representant resultat av LTP induksjon i MPP-DG synapse av et fritt oppfører mus. Merk posttetanic stimulering forbedring av fremmed reaksjon amplitude indikerer LTP induksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen, har vi demonstrert en pålitelig og enkel metode for å studere LTP i DG i fritt oppfører mus. Mens mange studier av LTP i våken rotter har blitt utført 3,4, svært få har blitt gjennomført i våken mus hovedsakelig på grunn av den tekniske kompleksiteten som utgjøres av den begrensede kranie eiendomsmegling i mus og vekten av elektrode headstages i forhold til den gjennomsnittlige vekten av mus fem. De få studiene som har vist LTP i DG i fritt oppfører mus benyttes enten Microdrive elektrodesystemer eller veikryss felteffekttransistor (JFET) preamplifiers integrert i heads som nødvendigvis legger til elektroden nyttelast byrde for dyret 6-10. Betydningen av denne protokollen er at den representerer en forbedring i forhold til eksisterende metoder for å indusere LTP i DG i fritt oppfører mus som det unngår bruk av Microdrive elektrodesystemer eller en heads JFET-tallet.
Det er viktigtig å markere de kritiske trinnene i denne protokollen. Disse omfatter: 1) montering av mus hode i stereotaxic rammen slik at den er bilateralt stivt (dette trinn kan være den vanskeligste som det krever øvelse og kjennskap til teknikken), 2) en optimal plassering av elektrodene for å maksimere responsen magnitude kan forbedres ved å forsikre at bregma, og lambda er i samme plan som kan vanligvis oppnås ved å justere stereotaksisk ramme tann bar slik at forskjellen i dorsoventral plassering av bregma, og lambda ikke er større enn 0,1 mm, 3) under innspillingen fase eksperimentet, er det anbefalt at dyrene gis tid til å venne seg til opptaks miljøet fordi nyheten av opptaksmiljøet kan antyde svingninger i fremmed reaksjon data innsamlet, 4) egnet valg av elektroder vil forbedre signalkvaliteten og gjengivelse: bipolare elektroder ( rustfritt stål sprøyte rør med 0,2 mm rustfritt ståltrådinnlegget med en spiss separasjon på 0,5 mm) foretrekkes for å stimulere mens monopolare elektroder (Epoxylite isolert enkeltstrenget wolframtråd) brukes for opptak i nervevev, og 5) mus kan bedøves ved hjelp av en intraperitoneal injeksjon av en blanding av ketamin (25 mg / ml), xylazin (2,5 mg / ml) og acepromazin (0,5 mg / ml). Denne bedøvelse blanding bør deretter administreres i en dose på 1ml/kg som vanligvis er effektive i omtrent 20 min supplert med 0,2 ml / kg hver 45. min for å opprettholde en stabil dybde på anestesi.
Det er noen begrensninger i denne protokollen som bærer nevne. Denne protokollen gir ikke noen innsikt på ionekanal mekanismer eller reseptor protein syntese som kan subserve LTP. Derfor snaut informasjon er tilgjengelig om de faktiske tallene av nevroner i befolkningen blir registrert. En annen begrensning er at siden fremkalt respons blir oppsamlet i våkne dyr, er det vanskelig å ascertain og dissekere ut virkningen av faktorer som for eksempel stress, håndtering, eller forurensning av det registrerte signal med falsk sensorimotor aktivitet. Disse begrensningene kan overvinnes ved å sikre at vakte reaksjoner registreres bare når dyret er inaktive, men våken tilstand, ellers kjent som den stille våkne årvåkenhet tilstand.
Likevel, de teknikkene som er beskrevet i denne protokollen gir den mest fysiologisk relevant plattform for å undersøke hjernens elektriske aktivitet underliggende atferd. Etter fremgangsmåten i denne protokollen, kan noen hjernens struktur være målrettet ved å bruke de riktige koordinatene som gis av en atlas av musen hjernen en. Det er viktig å merke seg at den voksne rotte stereotaksisk ramme kan benyttes i mus, forutsatt at egnet babyrotte øret mansjetter brukes i stedet for den vanlige ørepropper stolpene. Øret mansjetter vil immobilisere hodet uten å skade mus ører. Endelig kan de metoder som presenteres her være readily oversatt til elektrofysiologiske undersøkelser i transgene og knockout musemodeller av en rekke nevrologiske lidelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne følgende: Dr. Joseph Bronzino, Dr. Khamis Abu-Hassaballah, Mr. RJ Austin-LaFrance, og Ms Jessica Koranda.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine (100 mg/ml) | Henry Schein | 10177 | |
| Xylazine (20 mg/ml) | Henry Schein | 33197 | |
| Acepromazine (10 mg/ml) | Henry Schein | 2177 | |
| Dental acrylic powder | Lang Dental Manufacturing Co. | 1330CLR | |
| Dental acrylic liquid | Lang Dental Manufacturing Co. | 1306CLR | |
| Tungsten wire (0.127 mm) | World Precision Instruments | TGW0515 | |
| Stainless Steel Hypodermic Tubing (0.286 mm) | World Precision Instruments | 832400 | |
| Flunixin (50 mg/ml) | Henry Schein | 14165 | |
| Epoxilyte | Superior Essex | EP 6001-M | |
| Stainless steel wire insert (0.2 mm) | World Precision Instruments | 792900 | |
| Stereotaxic frame apparatus | Kopf Instruments | Model 902 | |
| Ear cuffs (ear cups) | Kopf Instruments | Model 921 | |
| Electrophysiological stimulator | Astro-Med, Inc. | S88 | |
| Digital oscilloscope | B K Precision Corp. | 2542 | |
| Current isolation unit | Astro-Med, Inc. | PSIU-6 | |
| Differential amplifier | World Precision Instruments, Inc. | DAM-50 | |
| Commutator | Plastics One | SLC6 | |
| Dental drill | Stoelting | 58650 |
References
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. , Compact 2nd edn, Elsevier Academic Press. (2004).
- Bliss, T. V. P., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J. Physiol. 232, 331-356 (1973).
- Blaise, J. H., Bronzino, J. D. Effects of stimulus frequency and age on bidirectional synaptic plasticity in the dentate gyrus of freely moving rats. Exp. Neurol. 182, 497-506 (2003).
- Blaise, J. H., Koranda, J. L., Chow, U., Haines, K. E., Dorward, E. C. Neonatal isolation stress alters bidirectional long-term synaptic plasticity in amygdalo-hippocampal synapses in freely behaving adult rats. Brain Res. 1193, 25-33 (2008).
- Koranda, J. L., Masino, S. A., Blaise, J. H. Bidirectional synaptic plasticity in the dentate gyrus of the awake freely behaving mouse. J. Neurosci. Methods. 167, 160-166 (2008).
- Cooke, S. F., et al. Autophosphorylation of alphaCaMKII is not a general requirement for NMDA receptor-dependent LTP in the adult mouse. J. Physiol. 574, 805-818 (2006).
- Davis, S., Bliss, T. V., Dutrieux, G., Laroche, S., Errington, M. L. Induction and duration of long-term potentiation in the hippocampus of the freely moving mouse. J. Neurosci. Methods. 75, 75-80 (1997).
- Jones, M. W., Peckham, H. M., Errington, M. L., Bliss, T. V., Routtenberg, A. Synaptic plasticity in the hippocampus of awake C57BL/6 and DBA/2 mice: interstrain differences and parallels with behavior. Hippocampus. 11, 391-396 (2001).
- Zhang, T. A., Tang, J., Pidoplichko, V. I., Dani, J. A. Addictive nicotine alters local circuit inhibition during the induction of in vivo hippocampal synaptic potentiation. J. Neurosci. 30, 6443-6453 (2010).
- Tang, J., Dani, J. A. Dopamine enables in vivo synaptic plasticity associated with the addictive drug nicotine. Neuron. 63, 673-682 (2009).
